UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZAN FALCULTAD DE MEDICINA

MICROSCOPIA, METODOS DE ESTUDIO HISTOLOGICOS Y TECNICAS DE CULTIVO

Lic. Biloga Nilda Huayta Arapa

Laureano Durand, Bill Edson Jefferson Lijarza Ushiahua, Jhadyra Kiara Lopez Ramirez, Verlin Robert Machado Aguirre, Yossi Yessila Mandujano Rubin, Carlos Alberto Nuez Guillen, Juan Luis Arturo Obregon Morales, Berea Orneta Leiva, Julio Cesar Bladimir Palomino Boncun, Sergio Miguel Palomino Miraval, Nayarita Otiana Pazos Gaspar, Sheendra Yurianne Ponce Rodriguez, Alexandra Quintana Solis, Yessica Yuliana

MICROSCOPA
Es el conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango de resolucin del ojo normal.

MICROSCOPIO
ETIMOLOGA: Del griego mikros: pequeo skopeoo: observar

DEFINICION: Es un instrumento ptico que aumenta el tamao de la imagen de un objeto y la hace visible o bien observable en detalle.

BREVE HISTORIA:
El microscopio fue inventado hacia los aos 1610, por Galileo Galilei, segn los italianos, o por Zacaras Janssen, en opinin de los holandeses. 1665: Hooke, utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeos poros en forma de caja a los que l llam "clulas". publica su libro Micrographia 1674: Leeuwenhoek, informa su descubrimiento de protozoarios. observar bacterias por primera vez 9 aos despus. es considerado el padre de la microscopa

OBJETIVOS DE LA MICROSCOPIA

Conocer la estructura, la composicin de clulas y tejidos, empleando mtodos y tcnicas; para llegar a estos conocimientos

Permite los procesos de clonacin

Tratamiento y prevencin de diversas enfermedades que perjudican el desarrollo integral del ser humano.

PARTES DEL MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO

El microscopio est compuesto de tres partes
PARTE MECNICA PARTE OPTICA SISTEMA DE ILUMINACION

BRAZO

CREMALLERA

PIE O SOPORTE

TORNILLO MICROMETRICO

PARTE MECNICA
PINZAS TUBO OCULAR

PLATINA

TORNILLO MACROMETRICO

PARTE OPTICA
OCULAR Se localiza en la parte superior del tubo ocular y son las lentes que Capta y ampla la imagen formada en los objetivos. OBJETIVO Se encuentran incrustados en el revolver y determinan la cantidad total de aumento LA LUPA(4X): Observaciones a bajo aumento OBJETIVO SECO DEBIL(10X):Localizar la imagen OBJETIVO SECO FUERTE(40X): Aumenta la imagen anterior. EL OBJETIVO DE INMERSION (1OOX):Lente especial usa aceite de inmersion

El aceite de inmersin aumenta considerablemente la eficacia de los objetivos

SISTEMA DE ILUMINACIN
CONDENSADOR Permite dirigir y condensar la mayor parte de los rayos luminosos en la preparacin DIAFRAGMA Elimina el exceso de luminosidad para tener una buena iluminacin del objeto a a observar FUENTE DE LUZ ESPEJO

Foco que da energa elctrica que dirige sus rayos luminoso al condensador

Permite que los rayos de luz se dirijan hacia el eje ptico

RESOLUCION
PODER DE RESOLUCION LIMITE DE RESOLUCION

Capacidad de distinguir como imgenes distintas dos cercanas. Se mide utilizando como inversa el lmite de resolucin.

Distancia mnima que debe separar a dos puntos de la muestra para ser resuelto por un instrumento ptico.

(poder de resolucin = 1/lmite de resolucin)

Lmite de resolucin =o.61 x longitud de onda/apertura numrica

LONGITUD DE ONDA

LONGITUD DE ONDA

Depender de la empleada; si se usa natural blanca, longitud de onda 550nm

luz luz la es

Lmite de resolucin: 0.61 x 550 / (1.51 x 0.93) = 335.5 / 1.4 = 240nm

Siendo en el ndice de refraccin (cambio en la velocidad de la luz difractada) del medio situado entre el objeto y la lente y el ngulo de apertura de la lente. Si el medio es aire, n =1. Si se utiliza aceite de inmersin, n = 1.51. El valor de seno es siempre menor que uno (0.93 como mximo en los microscopios actuales).

M. SIMPLE

Lupa, Monoculares y Vinculares Campo claro

MICROSCOPIO OPTICO

De campo oscuro De luz ultravioleta M. COMPUESTO De luz reflejada De polarizacin

TIPOS DE MICROSCOPIOS

De contraste de fases
De fluorescencia Confocal Campo brillante M. Transmisin MICROSCOPIO ELECTRONICO M. Barrido

MICROSCOPIOS SIMPLES
LUPA MONOCULARES PRISMATICOS O VINCULARES

MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO

Llamado tambin microscopio de transparencia, este microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz artificial para formar las imgenes

MICROSCOPIO DE CAMPO BRILLANTE

El material se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estn naturalmente coloreados.

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

La imagen es brillante sobre un fondo oscuro. Se evita que los rayos de luz que parten de la fuente luminosa lleguen a la muestra, se forma un cono hueco de luz, iluminndose la muestra con los rayos ms perifricos. El cono hueco de luz se logra utilizando un condensador de campo oscuro, filtro de retencin de luz en el plano focal del condensador.

Se vale del efecto TYNDALL para que mediante un haz de luz oblicuo, las clulas se eliminen.

MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA

La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las molculas de la muestra.

MICROSCOPIO DE LUZ REFLEJADA

Este tipo de microscopia es utilizada en el estudio de los metales y minerales metlicos y opacos. Por este motivo los microscopios especiales que requieren esta tcnica reciben el nombre de metalogrficos.

MICROSCOPIO DE POLARIZACION

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE

Se basa en la propiedad de ciertas sustancias (anistropas) que tienen un distinto ndice de refraccin segn la direccin que se considere

Utiliza para estudiar el material vivo en el cual no se puede aplicar las tinciones convencionales pues las clulas mueren en la fijacin.

MICROSCOPIO DE FLUORECENCIA

Se utiliza para el anlisis de clulas y tejidos que han sido tratados con colorantes fluorescentes (fluorocromos)

MICROSCOPIO DE CONFOCAL Adapta un sistema un de barrido mediante rayos lser que se concentra en un punto de muy poco espesor. Este rayo se desplaza mediante un sistema de espejos y rastrea punto por punto un plano de la preparacin

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMICIN El MET fue el primer tipo de microscopio electrnico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100000x Este tipo de microscopio no usa lente pticos sino lentes electromagnticos para el manejo de electrones Tiene un gran poder de resolucin ya que no emplea luz visible sino electrones acelerados Su resolucin es alrededor de 0.2nm

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO

Se usa para observar especmenes solidos. Con este microscopio es posible ver una imagen tridimensional del espcimen Este microscopio permite estudiar el material punto por punto Su principal utilidad es la observacin de la superficie de clulas, orgnulos y componentes tisulares. La resolucin esta entre 3y 20 nm

APLICACIONES MEDICAS

Estudio de ultra estructura de tejidos animales y vegetales. Reconocimiento de virus. Estudio de histoqumica. Morfologa superficial interna de partculas polimricas. Morfologa de tejidos u rganos de animales y vegetales. Diagnstico de clulas tumorales y para ver el crecimiento, dinmica y comportamiento de una gran variedad de clulas vivas en cultivo. Casos de inters clnico como la deteccin de diferentes sustancias minerales en los tejidos: slice y asbestos en los tejidos pulmonares, mica y almidn en granulomas postoperatorios, etc.

Mtodos histolgicos
La tcnica histolgica es una serie secuencial de pasos a travs de los cuales una muestra de tejido llega a transformarse en delgados cortes coloreados capaces de ser observados al microscopio.

PASOS DE LA TCNICA HISTOLOGICA

OBTENCIN

AUTOPSIA

BIOPSIA

Extraccin de un tejido muerto.

Extraccin de un tejido vivo

FIJACIN
CARACTERSTICAS

FIJACION FSICA

FIJACION QUMICA FIJACION QUIMICA COMPUESTA FIJACION QUIMICA SIMPLE

FIJACION
La fijacin es en esencia un mtodo para la preservacin de la morfologa y la composicin qumica de las clulas y los tejidos. Consiste en producir la muerte de las clulas, de manera tal que las estructuras que posean estas en el estado viviente se conserven con un mnimo de modificaciones, a lo largo del tiempo y de los subsiguientes pasos de la tcnica.

PROPIEDADES DE LOS FIJADORES

Producen una rpida muerte celular, evitando la autolisis. Preservan la morfologa celular y tisular. Preservan la composicin qumica. Penetran a los tejidos con relativa rapidez. Facilitan la coloracin posterior. Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la putrefaccin. Aumentan la consistencia de los tejidos. Algunos de ellos colorean sustancias de los tejidos.

DESHIDRATACIN

Despus que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata. Debido a que una gran parte del tejido est constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas (agente deshidratante) de menor a mayor.

ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIN

Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solucin de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusin a utilizar (en la mayora de los casos se utiliza como medio de inclusin Parafina lquida). La sustancia comnmente utilizada es el Xileno o Xilol.

INCLUSIN O IMPREGNACIN:

Este paso es lento pero los preparados son de gran calidad. El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia adecuada para el corte. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina (o resina). El objetivo de la inclusin es: distinguir entre s las clulas superpuestas en un tejido y la matriz extracelular; as como, tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte

SECCIN O CORTE

El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia ptica tienen un grosor entre 5 a 10 micrmetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.

MONTAJE Y TINCIN:

Los cortes para microscopia de luz convencional seccionados mediante hojas de acero inoxidable, se montan en portaobjetos de vidrio recubiertos con un adhesivo . La tincin para microscopia de luz se lleva a cabo principalmente con colorantes hidrosolubles, en consecuencia, primero es necesario eliminar la parafina del corte, despus se le hidrata y se tie

TINCION
Una tincin es un procedimiento para visualizar un tejido que puede implicar el uso de uno o varios colorantes. Un compuesto qumico es coloreado porque sus molculas absorben quantos de radiacin electromagntica en la parte visible del espectro. Combinacin de colorantes con el sustrato. Relaciones electrostticas Es el caso de colorantes cidos a estructuras bsicas (y viceversa).

COLORANTES:
Por qu colorear una muestra?

Los diversos elementos de los tejidos poseen prcticamente el mismo ndice de refraccin, lo que hace que el reconocimiento de distintas estructuras sea una tarea difcil.

DEFINICION DE COLORANTES
Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo. La coloracin es la propiedad que tienen ciertos cuerpos de ejercer una absorcin selectiva sobre la luz. Dicho de otra manera un cuerpo se ve de tal color porque transmite por transferencia o por difusin las radiaciones complementarias de las que el absorbe.

COLORANTES BSICOS
ANELINA Cl-

Los colorantes bsico reaccionan con los grupos ANIONICOS de los componentes texturados, que son los grupos fosfatos de los cidos nucleicos (ADN y ARN) los grupos SULFATO y los glucosaminoglicanos y los grupos CARBOXILOS de las protenas. La reaccin de estos grupos varan segn el pH.

COLORANTES CIDOS
Na+ ANILINA

Los colorantes cidos se unen primariamente a los componentes texturales por medio de enlaces electrostticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes bsicos. Las anilinas cidas reaccionan con grupos catinicos, como los grupos amino ionizados de las protenas.

METACROMASIA
Fenmeno por el cual un colorante cambia de color tras reaccionar con un componente textural. Se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES, la molcula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorcin son diferentes de las propiedades de molculas individuales.

CROMOTROPOS: Glucosaminoglucanos sulfatados, nucleoprotenas , cartlago, grnulos de los mastocitos. El cristal violeta tambin genera metacromasia.

TINCIONES MS UTILIZADAS
HEMATOXILINA- EOSINA: Tincin general. Dos colorantes: ncleo y citoplasma Tincin ms comn La H/E depender del tipo de hematoxilina Distingue la heterocromatina Los poliribosomas Zona negativa del Golgi

HEMATOXILINA
Extrada del parnquima de un rbol: Haematoxylum campechianum. Es incolora pero modificada en una reaccin de OXIDACIN ya sea natural o artificial obtenindose as la HEMATENA , debido a esta las hematoxilinas. En funcin al mordiente puede ser: A lumnicas Frricas Fosfotungsticas Plmbicas

EOSINA
Derivado halogenado del xanteno. Dos tipos : Eosina Y Eosina B. Molcula autofluorecente soluble en H2O y en OH. Carcter cido pues interacciona con el citoplasma y sus protenas, pintndolas de color ROSA.

GIEMSA
Tincin general empleada en la hematologa. Ayuda a distinguir grnulos de leucocitos y clulas endocrinas es una mezcla de colorantes aninicos y catinicos Una modificacin en los colorantes nos da el mtodo estandarizado RomanowskyGiemsa.

PAPANICOLAOU
Oracin histolgica utilizada en el contexto en la deteccin de carcinoma de crvix adems de esta tambin esta utilizada en esputo, orina, lquido cefalorraqudeo. Tcnica poli crmica en la cual no hay sobre coloracin debido al tipo de colorantes que se emplean. Tiene cuatro colorantes: colorante nuclear, eosina Y, verde brillante y orange G.

TRICOMICO
Se resaltan las fibras de colgeno. Tienen un colorante nuclear y al menos dos colorantes aninicos que estn asociados con heteropolicidos(PMA y PTA) El fijador indicado deber ser el Hg por su toxicidad fue cambiada por formol zinc y Zenker Bouin

TINCIONES SUBCELULARES
Son marcadores fluorescentes especficos para visualizarla dinmica de organulos incluso en clulas vivas.

HEMATOXILINA FERRICA

Colorante de Fuelgen Tcnica de tincin para teir selectivamente el material cromosmico. Consiste en la hidrolizacin del DNA y en la coloracin de leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehdos.

Colorea detalles celulares finos con mayor precisin, limpieza y prolongada permanencia.

AZUL DE TOLUINA

Tie estructuras basfilas como la cromatina. Tie las estructuras ricas en proteoglicanos sulfatados.

VIOLETA DE CRESILO

Colorante bsico que tie el ncleo

Tincin para la MITOCONDRIA

VERDE JANUS

Colorante bsico que cambia de color verde a azul en presencia del oxigeno en ausencia se reduce a rosa

Impregnacin argntica

Tincin para el APARATO DE GOLGI

La tcnica consiste en tratar el material con una solucin de una sal reducible de plata y a continuacin con un agente reductor

TINTA CHINA

COLORACIN NEGATIVA QUE DA UN FONDO SEMIOPACO

COLORACIN INTRAVITAL

Consiste en la administracin de colorantes vitales a travs de las vas digestiva o intratraqueal; mediante inyecciones sanguneas, linfticas, subcutnea, o intraperitoneal. Las soluciones de uso ms frecuente son: tinta china, carmn de litio, azul tripan (partculas colorantes que demuestran la capacidad fagoctica).

COLORACION SUPRAVITAL

Se emplean colorantes que se aplican a clulas o tejidos provenientes de organismos vivos. Los colorantes ms usados son: rojo neutro, verde jano, azul de metileno y naranja de acridina.

TINCIN NEGATIVA
EJEMPLO

Se encarga de teir todo menos la estructura que queremos visualizar

Conductos calcforos del tejido seo, lagunas de osteocitos

Esta tincin se emplea como mtodo de contraste en microscopa electrnica

NEGRO SUDN

El colorante negro sudn es un colorante de auxocromo azulnegro que tiene preferencia por los lpidos del tejido, tiiendolos de color negroazulado.

TINCIN PAS

El reactivo cido perydico de Schiff forman un precipitado de color magenta con molculas ricas en glucgeno y carbohidratos.

INMUNOCITOQUMICAS

DIRECTA

INDIRECTA

Se marca el anticuerpo contra la macromolcula con un colorante fluorescente.

Se prepara un anticuerpo con fluorescencia contra el anticuerpo primario especfico para la macromolcula.

INMUNOFLUORESCENCIA

Conjuga los anticuerpos con molculas de fluorocromos.

AUTORRADIOGRAFA

El mtodo en el cual se incorpora istopos radioactivos en macromolculas que se observan en una simulacin fotogrfica.

Cultivos celulares
Es el estudio de una proliferacin controlada con el fin de estudiar las funciones de la clula fuera de un organismo (in vitrio) o microorganismo.

Existen dos tipos de cultivo y son:

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

CULTIVO DE CLULAS ANIMALES

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

En este cultivo la mayora de microorganismos necesitan estar solo en un medio mnimo, el cual les proporciona nutrientes para su correcto crecimiento.

En los cultivos de microorganismos es ms fcil obtener una colonia celular denominada CLONACIN. La cepa celular genticamente homognea obtenida se denomina CLON.

CULTIVO DE CLULAS ANIMALES

Las clulas animales son ms difciles de cultivar que los microorganismos, dado que requieren muchos otros nutrientes; una caracterstica es que slo proliferan cuando estn adosadas a superficies con cubiertas especiales.

APLICACIONES:

Virologa: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas antivirales. En la actualidad las vacunas para enfermedades como el polio, sarampin, paperas, rubola y varicela se producen en cultivos de clulas de mamferos. Investigacin del Cncer Inmunologa: Gracias especialmente a la introduccin de las tcnicas de fusin celular en la produccin de anticuerpos monoclonales, as como en el anlisis de la gentica de la clula somtica.

 Ingeniera de protenas: Por la produccin de protenas en lneas celulares: interfern, insulina, hormona de crecimiento. Estudios de interaccin y sealizacin celular, en la diferenciacin y en el desarrollo: Comprende el estudio de los receptores y de las vas de translocacin de la seal. Aplicaciones diagnsticas: Por ejemplo en medicina y farmacologa destacan el anlisis cromosmico de clulas crecidas a partir de muestras de amniocentesis, deteccin de infecciones virales, ensayos de toxicidad. Aplicaciones mdicas: mantenimiento y produccin de tejidos para trasplante. Aplicaciones industriales y agronmicas: produccin por reproduccin "in vitro" de clones de plantas de inters comercial, y muchas otras.