Reglas Generales para el diseño de primers

2012 - 2

Reglas Generales para el Diseño de Primers
Parámetros
1. Secuencia única 2. G/C Clamp en el 3’

Valores Óptimos
Secuencia 3´es crítica para el anillaje. 1-2 G/C (S) nucleótidos

3. No ¨self-complementarity¨
4. No dímeros de primers 5. Composición en bases

< 3 bases contiguas
< 3 bases contiguas 45-55% del contenido G+C

6. Tamaño del primer
7. Tm

18-25 bases

8. Longitud y composición de la 100-600 pb de distancia secuencia a amplificar

Secuencia Única

La secuencia del primer debe ser única en el templado. No debe haber anillaje en posibles contaminantes.
AND Templado
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’ A TGCT AGTTG CAGTCAACTGCTAC TGCTAAGTTG

Primer Candidato 1 5’-TGCTAAGTTG-3’ Primer Candidato 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’

NO ES UNICO
UNICO

Secuencia Única
 

Secuencia 3´es crítica para el anillaje Secuencias 5’ puede ser ¨alterada¨ - por ejemplo para añadir sitios de restricción, codones de inicio, señales de secreción etc.-

3’
5’

3’

5’

Si

Dirección de la Síntesis
3’

5’

5’

3’

No

Tamaño del primer 7. Tm 18-25 bases 8. No dímeros de primers 5. No ¨self-complementarity¨ 4.Reglas Generales para el Diseño de Primers Parámetros 1. Composición en bases < 3 bases contiguas < 3 bases contiguas 45-55% del contenido G+C 6. Secuencia única 2. 1-2 G/C (S) nucleótidos 3. G/C Clamp en el 3’ Valores Óptimos Secuencia 3´es crítica para el anillaje. Longitud y composición de la 100-600 pb de distancia secuencia a amplificar .

usualmente servirán de primer  .Clam de G/C en el extremo 3’  El extremo 3’ debe tener G/C  Probabilidad del correcto anillamiento en el sitio en donde se añaden las bases Si hay 5 – 10 nucleótidos de complementariedad en el extremo 3’.

Secuencia única Valores Óptimos Secuencia 3´es crítica para el anillaje. G/C Clamp en el 3’ 3. No ¨self-complementarity¨ 4. 2. No dímeros de primers 5. Tm 1-2 G/C (S) nucleótidos < 3 bases contiguas < 3 bases contiguas 45-55% del contenido G+C 18-25 bases 8. Tamaño del primer 7. Longitud y composición de la 100-600 pb de distancia secuencia a amplificar Evitar la Formación de Estructuras Secundarias .Reglas Generales para el Diseño de Primers Parámetros 1. Composición en bases 6.

uidaho.pdf .edu/~heckendo/CS504/Students/P/waltari.ibest.Evitar la Formación de Estructuras Secundarias Hairpin Loops http://marvin.

Evitar la Formación de Estructuras Secundarias Self Dimers Cross Dimers .

Composición de los primers < 3 bases contiguas < 3 bases contiguas 45-55% del contenido G+C 6. Secuencia única 2. Tm 18-25 bases 8. G/C Clamp en el 3’ Valores Óptimos Secuencia 3´es crítica para el anillaje. No dímeros de primers 5. Tamaño del primer 7. No ¨self-complementarity¨ 4. Longitud y composición de la 100-600 pb de distancia secuencia a amplificar .Reglas Generales para el Diseño de Primers Parámetros 1. 1-2 G/C (S) nucleótidos 3.

Máxima diferencia de 2 – 3ºC  Contenido en (G+C): 50-60% da buenas T de anillaje y estabilidad de hibridación.Composición de los Primers Composición de bases:  % GC debe ser similar pues afecta:  Especificidad de Hibridación  Tm y T anillaje  Si tienen diferentes Tm no anillarán a la misma Tº. .

 . el extremo 3’ no anillará a la temperatura predicha.Reglas Generales para el Diseño de Primers Distribución aleatoria de los nucleótidos  Se prefiere una composición al azar de bases evitando regiones ricas en G/C o A/T Si todos los nucleótidos en el 5’ son G o C y en el 3’ A o T.

Reglas Generales para el Diseño de Primers Parámetros 1. Secuencia única 2. Longitud y composición de la 100-600 pb de distancia secuencia a amplificar . Composición en bases < 3 bases contiguas < 3 bases contiguas 45-55% del contenido G+C 6. Tm 18-25 bases 8. 1-2 G/C (S) nucleótidos 3. G/C Clamp en el 3’ Valores Óptimos Secuencia 3´es crítica para el anillaje. No dímeros de primers 5. No ¨self-complementarity¨ 4. Longitud del primer 7.

Longitud del Primer   Suficiente para asegurar que la secuencia a la que se anilla en el templado sea ÚNICA Pero no tan largo que afecte el Tm y el anillaje de forma radical Longitud probabilidad de ser único Tm y Ta más altas   Tamaño mínimo: 15 bases Tamaño optimo: 18-25 bases .

Secuencia única 2. No ¨self-complementarity¨ 4. Tm 18-25 bases 8.Reglas Generales para el Diseño de Primers Parámetros 1. 1-2 G/C (S) nucleótidos 3. Tamaño del primer 7. Composición en bases < 3 bases contiguas < 3 bases contiguas 45-55% del contenido G+C 6. Longitud y composición de la 100-600 pb de distancia secuencia a amplificar . G/C Clamp en el 3’ Valores Óptimos Secuencia 3´es crítica para el anillaje. No dímeros de primers 5.

Melting Temperature Tm  50% de la cadena forma una doble hélice estable y el otro 50 % está como cadena sencilla Depende    Longitud molécula Secuencia nts La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son doble cadena y la mitad cadena sencilla Tm depende de la fuerza iónica de la solución y del tamaño y composición del primer Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC .

Temperatura de Anillaje Ta Es la temperatura a la cual los primers se anillan con el ADN templado Ta = Tm_primer – 5C La Ta de ambos primers debe ser similar .

No ¨self-complementarity¨ 4. Secuencia única 2. Longitud y composición de la 100-600 pb secuencia a amplificar . Tamaño del primer 7. 1-2 G/C (S) nucleótidos 3.Reglas Generales para el Diseño de Primers Parámetros 1. Tm 18-25 bases 8. Composición en bases < 3 bases contiguas < 3 bases contiguas 45-55% del contenido G+C 6. No dímeros de primers 5. G/C Clamp en el 3’ Valores Óptimos Secuencia 3´es crítica para el anillaje.

Tamaño del fragmento a amplificar  Los mejores resultados se obtienen cuando el producto es de 100 – 600 pares de bases. Depende del grado de procesividad de la Taq polimerasa – diferentes tamaños óptimos  .

¿Cuándo un primer es un primer? 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ .

En Resumen  Únicos  asegura alta especificidad y reproducibilidad   Tamaño  15-25 bases.    . Melting Tm  entre 55-80 C. Diferencia de Tm entre primers  2 – 3 C. Minimizar estructuras secundarias internas  hairpins y dímeros. Composición de bases  promedio de contenido en (G+C) 50-60%. evite regiones largas ricas en (A+T) y (G+C).

Programas para el Diseño de Primers .

fhcrc.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/net prlaunch.org/codehop.de/genefisher/) GeneWalker (http://www.mit.html) Net Primer (http://www.techfak.cgi) Primer3Plus http://www.       Gene Fisher (http://bibiserv.cgi CODEHOP (http://www.wi.html ) .edu/cgibin/primer/primer3_www.se/primerdesign/) Web Primer (http://genome-www2.blocks.stanford.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.bioinformatics.unibielefeld.cybergene.edu/cgibin/SGD/web-primer) Primer 3 (http://www-genome.

.

.

albicans que codifica para un gen de resistencia.Ejercicio Diseñar un par de primers para la secuencia de ERG11 de C. Tener en cuenta que el fragmento amplificado no sea mayor de 600pb .

.

.

.

.

.

Candida tropicalis erg11 no. Accesión : AY942646 CDS: 518-2014 .

F´GATCCCATGGTTTGGTTCTG R´CCATGGTCTCTTTCCTTGGT .

F´CCCAAACTTGCCATTACCTC R´TTGGGACTCTCAATGGGTTC .

.

2 OC • 6. C= 63. D= 61.2010 PCR ERG 11-A C . E = 58.3 OC • 4.0 OC • 3. A= 65. gullermondii ATCC 6261 • 3.19. G= 55.7 OC • 7.0 OC • 8. MP • 2. B= 64.albicans Gradiente temperatura (-) MP A B C D E F G H (-) 1 2 3 • 1. C. glabrata ATCC 15120 • 2.8 OC • 9. F = 57. kruseii . H= 55.03.0 OC PCR ITS`s • 1. C. C.1 OC • 5.

A= 65. C= 63. MP 2.0 OC 8. F = 57.03. E = 58. D= 61. G= 55.8 OC 9.0 OC 3.albicans Gradiente temperatura (-) H MP A B C D E F G • • • • • • • • • 1.0 OC .2010 PCR ERG 11-B C . B= 64.7 OC 7.2 OC 6.3 OC 4. H= 55.1 OC 5.19.

nih.ncbi.Probar un par de primers….nlm.gov/ . http://www.