SDS-PAGE Electroforesis de Protenas en Geles de Poliacrilamida

Laboratorio de Biologa Molecular

Procedimiento
(Hoy al revs)

Vamos por pasos

1. Primero el montaje

2cm

2. Preparacin del Gel de Separacin

2 ml solucin de acrilamida y bis.

1, 25ml sln pH 8.8

Gel de Separacin

1,75 ml H2O

Justo antes de Servir agregar:

50 ul PA 8 ul TEMED

Agite y Sirva Inmediatamente

2. Preparacin del Gel de Separacin

2. Preparacin del Gel de Separacin

Sirva inmediatamente

Cubrir con agua des-ionizada

Polimerizar por 7 min

Gel de Separacin

3.Preparacin del Gel de Agrupamiento

650 ul sln acrilamida
1250 ul sln pH 6.8 3050 ul H2O 50 ul PA 10 ul TEMED
Gel Agrupamiento

3.Preparacin del Gel de Agrupamiento

Sirva inmediatamente

Poner los peines

Polimerizar por 5 min
Gel de Agrupamiento

Servir ulde deMuestra Muestra Servir 15 8 l

4. Corrido Electrofortico
Buffer Tris-Glicina Corrido 100 V por 150 min.

PAGE:
POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS

Ahora s

Electroforesis en gel de acrilamida

1959 Raymond y Weintraub (PAGE)
Caractersticas de geles de poliacrilamida:
Qumicamente inertes. Buena resolucin de separacin. Estables en un amplio rango. pH. Temperatura . Fuerza inica. Variando la concentracin de polmeros, se puede modificar

de manera controlada el tamao del poro. Estandarizacin de acuerdo a la muestra.

Electroforesis en gel de acrilamida

Concentracin 3.5 a 20%. Resolver fragmentos pequeos (10 - 1000 pb).
Evitar fragmentos >3kpb.

Separacin de fragmentos que varan en 10 20 pb. ssDNA.

Electroforesis en gel de acrilamida

Tasa de migracin
Tamao. Presencia de

estructuras secundarias.

Anlisis
Secuenciacin. Protenas/Enzimas. Pptidos.
http://aportes.educ.ar/biologia/seuenciacion________.jpg

Gel de Poliacrilamida

Componentes: Buffer pH Acrilamida Bisacrilamida

Polimerizacin
Polimerizacin sistemas catalticos redox
Persulfato de Amonio (ag. oxidante) + TEMED

(ag. reductor)
PA + 3-dimetilamino propionitrilo (DMAPN) H2O2 + sulfato de hierro + c. ascrbico

Geles de Poliacrilamida

PAGE (Polyacrilamide Gel Electrophoresis)

Nativa
No condiciones denaturacin estudios funcionalidad

Actividad enzimtica Unin a anticuerpos Unin a receptores

http://patentdocs.typepad.com/photos/uncategorized/2007/05/04/ antibody_large.gif

PAGE - Nativa
Migracin en funcin de: Carga Tamao Forma Permanecen interacciones entre: Subunidades Protenas

http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/quaternary_structure.jpg

PAGE - Denaturante
Agentes Detergentes (SDS) Urea Formamida

Migracin en funcin de: Carga Tamao

http://content.answers.com/main/content/wp/en/t humb/a/ab/250px-Protein-structure.png

SDS - PAGE
Estructura SDS

Detergente inico de carga (-) Fuerte carcter denaturante CH3(CH2)10CH2=SO3-Na+ Anin protenas

Denatura protenas
Rompe uniones no covalentes estructura 3 y 4

SDS - PAGE
Dodecil interior Sulfato superficie

CARGA (-)

Utilizados Mayora de protenas solubles en SDS Complejos carga (-) Separacin masa molecular SDS-protena fcil tincin

SDS - PAGE
Tratamiento agente reductor S-S (DTT / Beta

mercaptoetanol)
Denaturan protenas Rompe en subunidades

http://www.steve.gb.com/images/science/sds_page.pn

SDS-PAGE

Efecto SDS y DTT en movilidad electrofortica

Gel de Poliacrilamida Discontinuo

Componentes: Buffer pH Acrilamida Bisacrilamida

Electroforesis de Protenas en Geles de Poliacrilamida Discontinuos

Inicio de la Electroforesis Proceso de Apilamiento Proceso de Separacin

Agrupamiento

Separacin

Sistema Electrofortico Discontinuo

Gel de Agrupamiento-Compacta las Protenas
Tamao del poro Grande

No restrictivo tamao del

poro
pH ms cido
4%

Se polimeriza sobre el gel de separacin

Sistema Electrofortico Discontinuo

Gel de Separacin-Separa las Protenas
Zona de resolucin Tamao del poro menor Gel Restrictivo pH ms bsico 12%

Procedimiento

Servir ulde deMuestra Muestra Servir 15 8 l

Corrido Electrofortico
Buffer Tris-Glicina Corrido 100 V por 180 min.