Prctica No.

5 Tcnica de Tincin de Gram

Karina Zayetzi Aguirre Snchez Liliana Palacios Carolina Tejocote

Qu es tincin?
Es un mtodo utilizado para estudiar microorganismos mejorando el contraste en la imagen vista al microscopio. En estas tinciones se observa morfologa, estructura y agrupamiento de microorganismos. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan para resaltar estructuras en tejidos.

Para que se utiliza

Con ayuda de los diferentes colorantes es utilizado para aumentar la definicin y examinar grandes cortes de tejido, poblaciones celulares o incluso para resaltar organelos dentro de clulas individuales.

Tipos de Tinciones
Existen tres tipos de tcnicas de tincin:
1.

Tincin simple:
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico.
Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color.

La tincin simple mejora la observacin de la clula completa.

Tincin diferencial:

Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos.

La tcnica de tincin diferencial consta de dos etapas: una tincin primaria (siguiendo el mismo mtodo que en una tincin simple) seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer colorante.

Tincin especifica o de estructuras:

Incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen los flagelos y las cpsulas.

Tincin de Gram

Es la tincin mas usada en microbiologa. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Se considera una tincin diferencial Las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tincin de Gram. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas

Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano.

La pared de la clula Gram-negativa contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano.

Clasificacin segn agrupacin

Agrupacin en cadena Ejemplo: streptococcus

Agrupacin en racimos Ejemplo: staphylococcus

Agrupacin en empalizada Ejemplo: difteroides

Clasificacin segn forma y tincin

Cocos Gram positivos

a)

Genero: staphylococcus Staphylococcus aureus Genero: Streptococcus Streptococcus grupo A,B,C,G,D Enterococcus Streptococcus pneumoniae

b)

Cocos Gram negativos

a)

Genero: Neisserias Neisserias meningiditis Neisserias gonorrhoeae

b)

Genero: Moraxxela

Bacilos Gram positivos

-Genero: Listeria Monocytogenes -Genero: Corynebacterium -Genero: Bacillus anthrasis

Bacilos Gram negativos

E. coli Salmonella typhi Salmonella enterinditis Shigella Vibrio cholorae Campylobacter jejuni Klebsiella pneumoniae Proteus Pseudomonas aeruginosa

Bacilos Gram negativos relacionados principalmente con vas respiratorias

Haemophilus influenzae
Bordetella pertussis

Bacilos Gram negativos que causan Zoonosis

Brucella Francisella tularensis Pasteurella multocida

COLORANTES

Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen molculas de cido teicoico.

El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin.

Es ms difcil decolorar una clula Gram positiva que una Gram negativa.

El cristal violeta es el colorante primario de la coloracin de gram que se adhiere a la pared celular bacteriana, por lo tanto como colorante primario cumple como funcin permitir la identificacin de bacterias cuya estructura y composicin de pared celular se encuentre mayor proporcin y distribucin de cido teicoico. El lugol o mordiente cumple la funcin de fijar el colorante primario en la preparacin, es decir facilita la adhesin del cristal violeta en la muestra.
El alcohol sirve como decolorante

La safranina es el colorante de contraste, dado que las bacterias con baja composicin de cido teicoico y alta composicin lipdica en su pared no absorben el cristal violeta luego de ser removido con el alcohol cido absorben este colorante color rojizo

El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria, y lo colorean de violeta obscuro a purpura. Las bacterias que conservan este color despus de agregar el alcohol se clasifican como Grampositivas y las que pierden el color violeta Gramnegativas.

Las bacterias Gramnegativas son incoloras despus del lavado con alcohol, por ese motivo se les aplica un colorante bsico safranina (colorante de contraste)que las vuelve rosadas.

En las clulas Gramnegativas el alcohol altera la capa externa de lipopolisacarido y el complejo CV-1 se elimina de la capa delgada de peptodiglucano, en consecuencia las celulas Gramnegativas son incoloras.

Los bacilos y cocos (violetas) son Grampositivos y los vibriones (rosados) son gramnegativos.

Proporciona informacin valiosa para el tratamiento de ciertas enfermedades Las bacterias Grampositivas suelen ser destruidas fcilmente por las penicilinas y las cefalosporinas. Las bacterias Gramnegativos por lo general son mas resistentes porque los antibiticos no pueden atravesar la capa de lipopolisacarido.

PRACTICA
Objetivo: Conocer y manejar la tcnica de tincin de Gram de acuerdo con la estructura celular de las bacterias Gram(+) y Gram(-).

Preparacin de reactivos 1 g. cristal violeta ---- 100 ml alcohol Lugol 2 g. Kl + 1 g. I metlico -- 300 ml alcohol Alcohol cetona 80 ml alcohol + 20 cetona Safranina 1 g. safranina --- 100 ml alcohol

1.- Hacer un frotis de cada uno de los microorganismos y dejarlos secar al aire 2.- Fijar los brotes al calor 3.- Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlos actuar durante un minuto .Escurrir el colorante y lavar. 4.- Cubrir los frotis con lugol, dejarlos un minuto, escurrir y lavar. 5.-Decolora con alcohol- cetona de 5-30 seg., escurrir y lavar. 6.- Cubrir los frotis con safranina y dejarla durante 10 seg., escurrir y lavar 7.-Dejar secar al aire 8.- Hacer anotaciones y dibujos

Bibliografa
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/do cumen/uni_02/56/cap305.htm http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotec nologia/practico4.pdf http://realisaciondeanalisis.blogspot.mx/2012/06/tinciones-usadasen-microbiologia.html http://es.slideshare.net/Prymer/gram-positivos-y-negativos http://alquimiayciencias.blogspot.mx/2009/02/dora-este-articulo-espara-vos.html http://es.slideshare.net/Altajimenez/tabla-de-bacterias-grampositivas-y-negativas http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/image s/file/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%203%20Tinci% C3%B3n%20de%20Gram.pdf Tortora-Funke-Case Introduccion a la microbiologia