Cultivos Celulares

Profesor encargado: MNICA SILVA MONASTERIO Asignatura: BIOQ !MICA APLICA"A #M$du%o II& Carrera de Tecno%og'a M(dica Segundo A)o Escue%a de Tecno%og'a M(dica*

TPICOS
Infraestructura y equipamiento de la Sala de cultivo. Manejo de la Sala de Cultivo. Trabajo en condiciones Estriles. Cultivo celular: tcnicas y tipos de cultivo matrices para ad!esi"n aplicaciones materiales medios de cultivos con#elamiento y descon#elamiento de l$neas celulares suplementos contaminaci"n y uso de #ermicidas. %btenci"n y Mantenimiento de l$neas celulares. Cultivo &rimario de m'sculo esqueltico. Criterios para mantener un cultivo y distin#uir los diferentes estadios de las clulas. (si#naci"n de trabajos de investi#aci"n.

Introduccin
)a Sala de Cultivo es un laboratorio especiali*ado en infraestructura y equipamiento para poder trabajar en condiciones de Esterilidad. (dem+s permite #enerar y manipular en forma optima y se#ura los cultivos celulares.

Equipamiento

Materiales

Medio de Cultivo
El medio de cultivo proporciona in vitro un ambiente favorable y condiciones optimas muy similar a las de crecimiento de las clulas in vivo. Su funci"n es mantener el p, y la osmolaridad y proveer de nutrientes para la biosintesis estructura y metabolismo celulares. )a formulaci"n del medio de cultivo se basa en la composici"n de fluidos biol"#icos como plasma linfa suero y e-tractos de tejidos de ori#en embrionario e-istentes en los animales. El medio de cultivo completo se compone de Medio Basal suplementado con Suero.

Medio Basal
&roporciona los nutrientes y sustancias m$nimas requeridas .que las clulas no pueden sinteti*ar/ para su "ptimo mantenimiento y crecimiento. 0ependiendo de los requerimientos de cada tipo de l$nea celular o cultivo primario estos medios pueden ser 1&MI 0MEM 234 235. El medio basal debe contener 6lucosa como fuente ener#tica amino+cidos esenciales )76lutamina prote$nas vitaminas sales inor#+nicas y tampones como bicarbonato o !epes para mantener el p, y la osmolaridad. El medio basal una ve* preparado debe filtrarse con filtros de 5 4 um y ser #uardado a 89C.

Suplementos
Antibiticos
Es esencial el uso de (ntibi"ticos .&enicilina:Estreptomicina/ para evitar contaminaciones con bacterias y el uso de (ntif'n#icos como (mfotericina ; especialmente si se trata de cultivos primarios de "r#anos de cavidades abdominales o tejidos epiteliales.

Suero
El principal suplemento que se a#re#a al medio de cultivo es el Suero #eneralmente el Suero 2etal ;ovino. Este contiene un c"ctel de factores de crecimiento y nutrientes para que las clulas proliferen y se manten#an en condiciones "ptimas. E-isten otros suplementos como factores de crecimiento de diferenciaci"n y !ormonas que a veces es necesario a#re#ar en etapas espec$ficas del cultivo. Medios de cultivos y condiciones espec$ficas de mantenci"n

Esterilidad en la Sala de Cultivo

Ade+,s es +u- i+.ortante e% uso de c%oro en %os residuos %'/uidos /ue se desec0an*

Cultivo Celular
Es un modelo de estudio in vitro constituido por clulas que pueden crecer y mantenerse en suspensi"n o en monocapa por m+s de 48 !oras. )os cultivos celulares pueden ser obtenidos a partir de e-plantes de biopsias .fra#mento escindido desde un "r#ano o tejido/ por perfusi"n de un "r#ano espec$fico por dis#re#aci"n de tejidos o a partir de fluidos or#+nicos como la san#re. E-isten dos cate#or$as de cultivo celular.

Cultivo Primario Se define como aquel que se ori#ina

directamente a partir de clulas tejido u "r#ano de un animal . El cultivo primario es la mejor apro-imaci"n a un or#anismo vivo. Este puede preservar las funciones de un "r#ano o tejido puesto que posee la capacidad de diferenciaerse. El cultivo &rimario es considerado como tal !asta el primer subcultivo.

!"nea Celular Sur#e a partir del primer replique o pasaje

de un cultivo primario.

Obtencin # establecimiento de !"neas celulares

=na l$nea celular queda establecida cuando se demuestra su potencialidad de replicarse indefinidamente. )as l$neas celulares poseen propiedades o marcadores espec$ficos conferidos por diferencias en la dotaci"n cromos"mica .aneuploid$a/ mutaci"n o transformaci"n #entica que deben persistir entre sucesivos pasajes o subcultivos. )as l$neas o cepas celulares con al#una caracter$stica puntual pueden ser seleccionadas espec$ficamente mediante clonaci"n.

$i%erencias entre Cultivos Primarios # Cultivo de !"neas celulares

T&cnicas de Cultivo primario

M'sculo esqueltico de 1at"n por 0is#re#aci"n.

&rimera Etapa: 0isecci"n

&rimera Etapa: 0isecci"n

Se#unda Etapa: 0is#re#aci"n y siembra

Tercera Etapa: Mantenimiento

Cultivo Primario de 'atn

2ibroblastos en placa de preplaqueo.

Clula satlite mioblasto y miotubo.

Cultivo Primario de 'atn

Miotubo en el d$a 8 del cultivo.

Miotubo en el d$a > del cultivo.

Cultivo Primario de 'atn

Miotubos en el d$a > del Cultivo &rimario.

Miotubos en el d$a ? del Cultivo &rimario.

Materiales
Material Biol(ico neonato de rat"n con menos de 48 !oras de nacido. Material de $iseccin Tijera punta roma .3/ Tijera punta fina .3/ &in*as diente de rat"n .3/ Microforceps .4/ Tijera de iridectom$a

Materiales
Material de vidrio # pl)stico @aso pp. de 355 ml .4/. &lacas de cultivo de 355mm .A para disecci"n/. Berin#as de 35 ml y 45 ml .4 de cada una /. Tubo c"nico de >5 ml. &ipetas de > y 35 ml. &ortafiltros armado con disco de nyte.4/. &ortafiltros desec!able de nitrocelulosa de 5.4 um .4/.

Soluciones
(lco!ol C5D. &;S. 35 ml de Cola#enasa 4m#:ml en &;S .disolver en el momento de usar/. (ra7C 3 mM.

Medios de Cultivo
Medio de Crecimiento: 0MEM 2734 ,am E 35D Suero ;ovino (dulto .S;(/ E 4.>D Suero 2etal ;ovino .S2;/. Medio de 0iferenciaci"n: Se disminuye el S2; a 3.>D en el medio de crecimiento. Fota: Todo el material e-cepto vasos pp debe estar autoclavado. )as soluciones e-cepto el alco!ol deben ser microfiltradas por 5.44 um.

M&todo Cultivo &rimario de 1at"n Se a#re#an > ml de cola#enasa 4 m#:ml

sobre el tejido que fue picado con tijera. 0is#re#ar con jerin#a de 45 ml y depositar en tubo c"nico de >5 ml e incubar por 35 minutos y repetir. 0etener la reacci"n con 35 ml de Medio de Crecimiento y vaciar a una placa. 2iltrar a travs de nyte- y recibir el filtrado en un nuevo tubo c"nico. Centrifu#ar por 35 minutos a 3555 rpm. (spirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 35 ml de medio de crecimiento.

M&todo Cultivo &rimario de 1at"n

Sembrar en placa de 355 mm incubando en estufa por 35 minutos .preplaqueo/. Sembrar con una confluencia del A5D. Incubar en estufa a AC9C >D de C%4 durante C4 !oras y a#re#ar 45ul de (1(7C. (l d$a si#uiente cambiar el medio de cultivo de crecimiento por el medio de cultivo de diferenciaci"n y mantener las clulas en presencia de ese medio !asta

T&cnicas de Cultivo Primario Cultivo de 2ibroblastos por e-plante

Metodo%og'a: Cu%ti;o de fi5ro5%astos desde e8.%antes

de enc'a*
Muestra de enc'a de .acientes Corte en tro7os de 9 8 9 ++ a.ro8* Te:ido conecti;o en contacto con %a .%aca a.enas cu5iertos con +edio Medio "MEM 123 4BS con anti5i$tico antif6ngico

La;ado tras.aso a .%aca de ;idrio

Tras.aso a .%aca de 19 .oci%%os

Sa%ida de c(%u%as desde e% e8.%ante 0asta un =2 > <2 3 de conf%uencia

Agregar +edio 0asta 1 +%* a %as <9 0rs* Reno;ar cada tres d'as*

Tri.sini7aci$n - e8.ansi$n

An,%isis .or Cito+etr'a de f%u:o .ara %a susce.ti5i%idad de fi5ro5%astos a a.o.tosis inducida .or distintos agentes t$8icos? usando IP*

Cultivo de !"neas Celulares

(s$ se !acen proliferar cambiando el medio de cultivo todos los d$asG cuando alcan*an una alta confluencia debemos subcultivar y e-pandir para evitar que pierdan la capacidad de proliferar. &ara diferenciarlas se reempla*a el Suero 2etal por Suero de Caballo o se deprivan de suero en el medio de cultivo.

Inicio del cultivo de clulas M06

Clulas M06 despus de dos d$as de cultivo

Clulas M06 diferenciadas a miotubos

Subcultivo o replique de c&lulas

)as l$neas celulares que crecen en suspensi"n se pueden replicar traspasando un volumen pequeHo de ellas a otra placa o posillo y a#re#andoles medio de cultivo completo. &or otra parte las clulas ad!erentes primero deben ser despe#adas de la superficie con una en*ima llamada tripsina y despus de esto se distribuye un volumen en otra placa o varias placas si se desea e-pandir el cultivo.

Con(elamiento de C&lulas
Se pueden con#elar en Fitr"#eno )$quido o a 7I59C para esto las clulas se centrifu#an y lue#o se resuspenden r+pidamente en una me*cla de medio de cultivo completo con 0MS% al 5 >D fr$o. El 0MS% evita que se formen cristales y astillas de !ielo que rompan o daHen las clulas. El descenso de la temperatura debe ser #radual. Esto se consi#ue colocando los crioviales en un contenedor de plumavit o en un Cooler con soluci"n de isopropanol. )as clulas se descon#elan aumentando la T9 r+pidamente a AC9C y deposit+ndolas en medio completo para diluir el 0MS% que es t"-ico.

Matrices .ara c(%u%as ad0erentes

@e%atina Co%,geno La+inina P%o%isina Matri>ge%

Traba*os de investi(acin
Cultivo de Clulas 0endr$ticas e Inmunoterapia celular. Stem Cells y Terapia Celular. Test de Micoplasmas. Cultivo &rimario de Feuronas !ipocampales y aplicaci"n en Investi#aci"n. Cultivo de ,epatocitos en Investi#aci"n e Industria 2armacol"#ica. Cultivo de ,ibridomas de linfocitos ; y producci"n de (nticuerpos monoclonales. Cultivo Celular en In#enier$a en ;iotecnolo#$a Cl$nica Industrial. &erspectivas y aplicaciones. Cultivo de Clulas de p+ncreas y 0iabetes. Cultivos de Cardiomiocitos como modelo de investi#aci"n de infarto al miocardio. Cultivo primario de neuronas de epitelio nasal como modelo de estudio de enfermedades neurode#erativas.