Departamento de Qumica e Bioqumica Enzimologia 2013/2014

Ana Carolina Cordeiro n 41900 Rebeca Crespo Fiadeiro n41888 Docente: Ana Ponces

Objectivo
Compreender o modo de ligao dos substratos ao Citrato Sintase

Mtodo
Estudos de cintica enzimtica atravs de inibio por anlogos de substrato

Citrato Sintase
EC 2.3.3.1 Acetil CoA + Oxaloacetato CoA-SH + Citrato

Mecanismo de complexo ternrio de dois substratos: Random Sequencial

Procedimento Experimental
Citrato Sintase de corao de Porco
[substrato] vs. velocidade para vrios [inibidor] Traar Lineweaver Burk Traar grficos secundrios
Boehringer Mannheim GmbH Suspenso cristalina Actividade especfica (95%)

Ensaio Colorimtrico: DTNB reage com CoA-SH formando TNB Abs412 Variao de [S1] Variao de [I1] Manter [S2]

Fornece informao sobre o tipo de inibio Possvel por ser enzima michaelis-menten

Fornece informao sobre o mecanismo de complexo ternrio

Substratos e Inibidores
ATP Acetil CoA Propionil - CoA

Oxaloacetato

2 - Oxoglutarato

ATP
Inibidor Competitivo Mecanismo sequencial ou ordenado? Grficos secundrios de declives Ordenada na origem e declive so inseridos na Equao de Dalziel

Propionil CoA

2-Oxoglutarato

Inibidores competitivos

Equao de Dalziel

Random Sequencial
Coeficientes de Inibio

Mecanismo Proposto
Mecanismo sequencial com oxaloacetato a ligar-se primeiro
oxaloacetato acetil-CoA

Eoxaloacetato

Eoxaloacetatoacetil-CoA

k2 > k1 k4 = 20 k1 k6 < k5 (Weidman et al.) k8=k9 para ATP e k8<<k9 para propionil-CoA Ligao da extremidade CoA no afectada pelo Oxaloacetato Ligao Oxaloacetato Alterao conformacional Aumenta afinidade para o Acetil-CoA que envolve o grupo Acetil

E : Citrato Sintase S1 : Acetil CoA S2: Oxaloacetato I1: Inibidor Acetil CoA I2: Inibidor oxaloacetato

Mecanismo Proposto
Interao enzimaoxaloacetato com grupo acetil:
Confere estabilidade ao complexo ternrio Orientao do grupo acetil para o centro cataltico

Cooperatividade positiva significante:

Interao entre os dois centros activos do enzima

Nota: Apesar do s diferirem entre si num grupo CH2:actividade Acetil-CoA = 104 Actividade Propionil-CoA especificidade do citrato sintase no devida apenas ao processo de ligao do substrato

Bibliografia
PETTERSSON Gsta ,The Kinetics of Substrate-Competitive Inhibition in TernaryComplex Mechanisms for Enzyme Reactions Involving Two Substrates, Eur. J. Biochem. 46,l-4 (1974) DALZIEL Keith,The Kinetics and Mechanism of Liver Alcohol Dehydrogenase with Primary and Secondary Alcohols as Substrates, Biochem. J. 100, 34 (1966) DALZIEL Keith, Initial Steady State Velocities in the Evaluation of EnzymeCoenzyme-Substrate Reaction Mechanism, Acta Chemia Scandinavia 11, 17061723 (1957) Enzyme Kinetics Principles and methods, Hans- Bisswanger, WILEY-VCH, 3rd Edition 2002 Enzymes A practical Introduction to Structure, Mechanism and Data Analysis, Robert A. Copeland, Wiley-VCH, 2nd Edition, 2000 Fundamentals of Enzymology The cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins Price and Stevens, Oxford University Press, 3rd Edition, 1999 Enzymes, Malcolm Dixon and Edwin Webb, Longman, 3rd Edition,1979

http://www.umich.edu/~elements/07chap/html/07prof2.htm