Tesis de Grado I

Estudio de la produccin de azucares fermentables a partir de la celulosa contenida en desechos agrcolas o industriales, a partir de una hidrlisis enzimtica.

Tutor Acadmico: Prof Rafael Martn Belmonte

Elaborado por: Daniela Narciso

Tesis de Grado I

Planteamiento del Problema

Introduccin

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Antecedentes

Antecedentes
Charles Wilke y Gautam Mitra (1974), patentaron el
proceso para la conversin de materiales celulsicos por medio de una degradacin enzimtica. Folke Tjerneld e Ingrid Persson (2004), estudiaron las particiones de la Trichoderma reesei con el objeto de disear un sistema de fases. Okazaki y Moon-Young (2005) desarrollaron un modelo matemtico de la cintica de la reaccin enzimtica,

basndose en el modelo de Michaelis-Menten.

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Objetivos

Objetivo General

Estudiar

el

proceso

de

hidrlisis

enzimtica
residuos

del

bagazo
de

de

caa

agrcolas

composicin

similar para la produccin de azcares fermentables.

Objetivos Especficos

Determinar las ventajas de la realizacin de un

pretratamiento del sustrato antes de la realizacin del proceso de hidrlisis.

Comparar el comportamiento de los diferentes sustratos en la produccin de los azcares

fermentables.

Objetivos Especficos
Determinar las condiciones de operacin ptimas para

cada uno de los sustratos en lo que se refiere a la

concentracin de enzimas, concentracin de sustrato y tamao de partcula de sustrato. Determinar las caractersticas principales del reactor que llevar a cabo dicho proceso a escala industrial. Establecer las diferencias bsicas entre la hidrlisis cida y la hidrlisis enzimtica.

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Marco Terico

Biomasa
Se denomina biomasa al grupo de productos energticos y materias primas de tipo renovable que se originan a partir de la materia orgnica formada por va biolgica.

Fuentes de Biomasa

Valor Energtico de la Biomasa

Caractersticas de la Biomasa
Amigable con el medio ambiente ya que su balance de emisiones de CO2 es cero. Es una fuente de energa renovable.

Permite reactivar la economa de zonas rurales y de pases

sin hidrocarburos. Generacin de gran cantidad de empleos. Aprovechamiento de recursos que antes eran en su mayora desechados. Est conformada por Lignina, Hemicelulosa y Celulosa.

Lignina
Es un polmero tridimensional que se forma a partir de las unidades fenilpropnicas que se han desarrollado, de manera aleatoria, formando una molcula grande y compleja con muchas clases diferentes de ligamentos entre los bloques estructurales. Por ser un compuesto de difcil degradacin, representa

el principal obstculo del proceso de hidrlisis.

Lignina

Hemicelulosa
La hemicelulosa es un polmero de cadena ms corta y

ramificada cuyos monmeros pueden ser de cinco

tomos de carbono, o de seis tomos de carbono. Son de naturaleza amorfa y sirven, con la lignina, para formar

la matriz en la cual se incrustan las fibrillas de celulosa.

Celulosa
La celulosa es un polisacrido lineal formado por

residuos de glucosa unidos por enlaces b 1-4.

stas cadenas lineales de celulosa interaccionan entre si

por medio de enlaces de puentes de hidrgeno dando

lugar a la formacin de microfibrillas.

Bagazo de Caa
El bagazo es el residuo del tallo o cuerpo de la caa de azcar que queda despus de que se le ha extrado el jugo, ya sea en el ingenio o en el trapiche. Entre los usos del bagazo tenemos: Produccin de biocombustibles. Abono.

Combustible en el ingenio.
Otros.

Composicin del Bagazo de Caa

Componentes
Humedad
Fibra

(%)
50
46

Brix
Impurezas Minerales

2
2

Componentes
Celulosa

(%)
50

Hemicelulosa
Lignina

25
25

Ventajas del Uso del Bagazo de Caa

Elevada

eficiencia

fotosinttica,

es

decir,

puede

sintetizar carbohidratos solubles a una tasa superior al de otros cultivos comerciales. Es un cultivo permanente.

La duracin de la cepa es de 5 cosechas.

La energa

invertida en la produccin de caa

representa, a lo sumo, el 5% de su potencial.

Enzimas

Las enzimas, tambin conocidas como biocatalizadores,

son aquellos compuestos protenicos que actan como catalizadores de numerosas reacciones biolgicas. Estas no modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aumentan la velocidad de la

reaccin.

Caractersticas de las Enzimas

Son efectivas en pequeas cantidades.

No

sufren

modificaciones

qumicas

irreversibles

durante la catlisis. Pueden catalizar procesos a bajas temperaturas No afectan la condicin de equilibrio de la reaccin que catalizan.

Clasificacin de las Enzimas

Grupo
Transferasas Hidrolasas

Accin
Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas molculas) a otras sustancias receptoras. Actan en reacciones de hidrlisis con la consiguiente obtencin de monmeros a partir de polmeros. Actan sobre determinadas molculas obteniendo de ellas sus ismeros de funcin o de posicin. Realizan la degradacin o sntesis de los enlaces denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de alto valor energtico. Realizan la degradacin o sntesis de los enlaces fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas en energa como los nucleosidos del ATP.

Oxidoreductasas Catalizan reacciones de oxidorreduccin.

Isomerasas Liasas

Ligasas

Cintica Enzimtica
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las

reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios

proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la

enzima.
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron

la teora de la cintica enzimtica y propusieron una

ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de las enzimas.

Ecuacin de Michaelis-Menten

Michaelis y Menten propusieron que las reacciones

catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas.

Celulasa
Son biocatalizadores de naturaleza proteica, que

participan en el rompimiento de los enlaces glicosdicos

b-1,4 presentes en los polisacridos celulosa, liberando al medio glucosa y otros monosacridos.

endo-b-glucanasas

exo-b-glucanasas

b-glucosidasa

Mecanismo de Accin de la Celulasa

Microorganismos Productores de Celulasa

Microorganismo Tipo de Respiracin Bacterias

Cellulomonas Aerbico

Pseudomonas Fluorescens
Clostridium Thermocellulaseum

Aerbico
Anaerbico

Hongos
Aspergillus Nger Fusarium Solani Trichoderma Reesei Trichoderma Viride Aerbico Aerbico Aerbico Aerbico

Aspergillus Niger

Pretratamientos
Los pretratamientos son requeridos para alterar la estructura de la biomasa para hacerla mas accesible a las enzimas que convertirn a las cadenas polimricas en azcares fermentables. La meta es romper el sello que forma la lignina y la hemicelulosa e irrumpir en la estructura cristalina de la celulosa.

Pretratamientos
Lignina Celulosa

Pretratamiento

Hemicelulosa

Objetivos de los Pretratamientos

Reducir la cristalinidad de la celulosa.

Disociar el complejo lignina-celulosa. Aumentar el rea superficial de la fibra de celulosa.

Disminuir la presencia de aquellas sustancias que

dificulten el proceso de hidrlisis.

Caractersticas de los Pretratamientos

Deben ser muy eficaces. Bajos costos de inversin y mantenimiento. Bajo consumo energtico.

Utilizacin de reactivos econmicos.

Posible aplicacin a diversos sustratos.

Tipos de Pretratamientos

Pretratamiento Qumico
Ozonlisis Hidrlisis con cido Diluido Hidrlisis con cido Concentrado Hidrlisis Alcalina Deslignificacin Oxidativa Organosolventes

Tipos de Pretratamientos
Pretratamiento Fsico Pulverizado Mecnico Pirlisis

Pretratamiento Fsico-Qumico
Explosin con Vapor

Agua Lquida Caliente (LHWP)

Explosin de fibra con Amonaco Pretratamiento Biolgico Pretratamiento con Hongos

Hidrlisis

La hidrlisis de residuos lignocelulsicos tienen como

finalidad la transformacin de los polisacridos que estos contienen en azcares sencillos, fermentables a su vez a

distintos productos de inters industrial.

La hidrlisis se puede llevar a cabo tanto por va qumica como por va biolgica.

Hidrlisis Qumica
Este proceso utiliza cidos como H2SO4, HCL y HF a

diferentes concentraciones, altas temperaturas y en

diversos procesos operativos.

Hidrlisis Enzimtica
La hidrlisis enzimtica de la celulosa consiste en la

utilizacin de enzimas celulolticas, producidas por

algunos hongos y bacterias, para obtener una solucin de glucosa a partir de dicho sustrato que es

originalmente insoluble.

Ventajas y Desventajas de la Hidrlisis Enzimtica

Ventajas
temperatura (30 50 C) La no utilizacin de agentes
qumicos, ya que as se evita la corrosin de los equipos y la degradacin producidos. Alta especificidad. de los azcares

Desventajas
la propia estructura de los

Opera a condiciones suaves de La lentitud del proceso debido a

sustratos celulsicos nativos.

La necesidad de recuperacin de las enzimas del medio de

reaccin.

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Metodologa

Laboratorio

Materiales

Complejo Enzimtico (Celulasa)

Bagazo de Caa

Reactivos

Solucin Amortiguadora Acetato

cido Dinitrosaliclico

Solucin de Glucosa de 40 mMol

Equipos

Bao Termostatizado

Equipos

Molino con tamiz incorporado

pH metro

Equipos

Plancha de Calentamiento y Agitacin Magntica

Espectrofotmetro

Equipos

Balanza Analtica

Balanza Galnica

Mtodo DNS
El seguimiento de la hidrlisis se realizar por medio de la determinacin del contenido de azucares fermentables

solubles por medio del mtodo del cido dinitrosaliclico.

El acido dinitrosaliclico se reduce formando el acido

3-amino-5-nitrosaliclico, mientras que el grupo aldehdo

reductor se oxida para formar un grupo carboxlico, lo cual causa diferencias de coloracin que pueden

determinarse por espectrofotometra, a una longitud de

onda de 570 nm.

Mtodo DNS
Se toma 0.4 ml de la solucin azucarada y se coloca en un tubo de ensayo. Aadir 4 ml de la solucin de DNS agitando para homogenizar. Calentar la muestra en un bao de agua a ebullicin durante 10 minutos. Enfriar la solucin a la temperatura ambiente en un bao de agua fra. Medir la absorbancia en un espectrofotmetro a 570 nm.

Mtodo DNS

Curva de Calibracin de Glucosa

Preparar soluciones con concentraciones conocidas de
glucosa. Aplicar el mtodo del DNS. Enfriar las muestras a la temperatura ambiente.

Calibrar el espectrofotmetro a cero con el blanco.

Determinar la absorbancia a 570 nm. Construir la curva de calibracin de glucosa graficando a la

absorbancia obtenida en funcin de la concentracin de

glucosa.

Acondicionamiento de la Materia Prima

Colocar al bagazo de caa en una estufa a 76 C durante 24 h. Moler el bagazo de Caa. Pasar el bagazo molido a travs de tamices.

Clasificar el bagazo segn su tamao de partcula.

Almacenar el bagazo en frascos de vidrio dentro de bolsas de plstico hermticas a temperatura

ambiente.

Pretratamiento LHWP
La porcin de bagazo de caa a ser pretratado se

coloca en una olla de presin con 2 litros de agua por 1 hora a 2 atm de presin.

Hidrlisis Enzimtica

Valores ptimos de las Variables de Operacin

Temperatura (C)
pH

37
5,0

Hidrlisis Enzimtica
Preparar soluciones de celulasa en buffer acetato a
pH = 5 y a las diferentes concentraciones de estudio. Pesar la masa de sustrato y sumergirlo en la solucin

de celulasa en buffer. La proporcin depender de la

relacin lquido slido que se pretende estudiar. Incubar la solucin en un bao termostatizado a 37 C

con agitacin suave.

Aplicar el mtodo del DNS a la solucin en ciertos intervalos de tiempo.

Estrategia de Anlisis

Concentracin Masa de Sustrato

de enzima

1,5 g/l

3 g/l

6 g/l

0,25 g 0,5 g

2g

Estrategia de Anlisis

Adicionalmente, se realizara pruebas para:

Diferentes tamaos de partcula. Bagazo sin pretratamiento. Otros sustratos.

Hidrlisis Qumica

En un erlenmeyer colocar la muestra de bagazo de caa en contacto con una solucin de H2SO4 al 4% y

a una relacin liquido/slido de 30/1. Colocar el recipiente en un bao termostatizado y

fijar la temperatura de reaccin en 100 C.

Agitar la mezcla de reaccin con un agitador

magntico.

Hidrlisis Qumica

Cada cierto tiempo se toman muestras de la solucin y se le aplica un enfriamiento brusco y se filtra a

travs de papel de filtro whatman No 1 para detener

la hidrlisis. Aadir a la solucin NaOH 2 M hasta lograr un pH de 4,5. Aplicar el mtodo del DNS.

Resumen de la Metodologa

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PREGUNTAS

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GRACIAS