PROTEMICA

Curso: Bioqumica Ano Letivo 2013/2014 Disciplina: Biologia Molecular Professor: Luka A. Clarke Alunas: Ins Silva n41698 e Patrcia Marques n42629

INTRODUO

O que a Protemica? O princpio da Protemica vs Genmica Tcnicas usadas na Protemica e respetivo equipamento Anlise e Interpretao de Resultados Aplicaes

O QUE A PROTEMICA?
o estudo, em grande escala, de protenas, nomeadamente, das suas estruturas e funes.
Principais componentes das vias metablicas fisiolgicas das clulas Protena Proteoma Genoma

A Protemica garante uma melhor compreenso do organismo, comparativamente Genmica. O objetivo, atualmente, consiste em conhecer conjunto de todos os genes de um organismo (Genoma) e compreender os mecanismos que se estabelecem entre as protenas por eles codificadas (Proteoma).

O PRINCPIO DA PROTEMICA VS GENMICA

Genmica:
- Determinar a estrutura das molculas de DNA atravs da identificao da sequncia dos componentes nucletideos. Primeiro passo para a interpretao das informaes genticas codificadas no DNA, as quais determinam as caractersticas estruturais e funcionais de cada ser vivo. Projeto Genoma: Estrutural: - sequenciamento completo do genoma. Funcional: - Regies codificantes de protenas - Funes celulares, metablicas fisiolgicas.

O PRINCPIO DA PROTEMICA VS GENMICA

Engenharia Gentica onde as diferenas entre espcies desaparecem

possvel devido: - Ao cdigo gentico (DNA): a fonte de informaes para a formao do organismo; - transcrio: transcrio da informao gentica contida no DNA para o RNA, que serve de molde para a traduo; - traduo: traduo de informaes genticas para uma estrutura proteica funcional.

Sequenciao Comparao com bancos de dados Verificao de homologia com genes previamente sequenciados

O PRINCPIO DA PROTEMICA VS GENMICA

Ps-Genmica

Os dados fornecidos pela Genmica ainda

precisam de ser decifrados

Funo das protenas?

Protemica

Genmica Genmica Funcional Protemic Estrutural a DNACristalografia Eletroforese 2D Microarra de raio x Espectrometria de y NMR Massa Sequenciamento de Protena Sequncia Forma Funo

O PRINCPIO DA PROTEMICA VS GENMICA

Um gene Mltiplas protenas

- Diferentes combinaes de exes por splicing alternativo - Processamento ps-traducional (ex. clivagem de pr-peptdeos) - Modificaes ps-traducionais (ex. glicosilao, acetilao) - Modificaes no dogma central: DNA RNA Protenas importante analisar os produtos provenientes do gene, e no tanto o gene em si

O PRINCPIO DA PROTEMICA VS GENMICA

Vantagens centrais da Protemica:

- Possibilidade de trabalhar ao nvel dos produtos gnicos, que so expressos e do origem a um produto final.
Limitaes centrais da Protemica:

- Apenas uma frao de protenas sintetizadas pode ser detetada numa anlise experimental.
Pr-requisito bsico da Protemica:

- O genoma sequenciado do organismo em estudo ou, pelo menos, uma poro de cDNAs.

TCNICAS DA PROTEMICA
Objetivos:

- O estudo da expresso gnica, atravs de certas tcnicas, permite obter um perfil molecular, bem
como identificar importantes alteraes que ocorrem ao nvel do RNA.

Nos estudos protemicos, podem ser combinadas diferentes metodologias.

As mais comuns envolvem: - A extrao de protenas da amostra - Separao por eletroforese uni (1D) ou bidimensional (2D) - Cromatografia liquida; Ionizao; Fragmentao - Anlise e deteo de pptidos - Anlise de dados

TCNICAS DA PROTEMICA
As metodologias empregues na Protemica podem ser classificadas em dois tipos:

bottom-up (ou shotgun) e top-down

Bottom-up inclui separao por cromatografia lquida dos pptidos obtidos aps a digesto por

tripsina de solues proteicas complexas, seguida da anlise por espectrometria de massa (MS).
Sensibilidade e reprodutibilidade (mesmo para proteomas complexos) Modificaes ps-traducionais no so reconhecidas; Alguns pptidos podem ser perdidos durante a

cromatografia

Top-down processo no qual as protenas intactas so submetidas anlise por MS.

A combinao destes mtodos com outros processos pode enriquecer a amostra contendo compostos de baixa abundncia ou de organelos celulares de interesse

TCNICAS DA PROTEMICA
o Separao de protenas por eletroforese uni e bidimensional
As molculas tm de ser inicialmente isoladas a partir de materiais biolgicos

Eletroforese uni (1D) e bidimensional (2D)

O procedimento de extrao varia de acordo com o tipo e origem das amostras biolgicas, mas, na maioria dos casos, as protenas precisam de ser solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e submetidas ao tratamento de agentes redutores.

TCNICAS DA PROTEMICA
o Eletroforese bidimensional (2D)
As protenas so separadas em 2 etapas consecutivas: Focalizao Isoeltrica (IEF) e SDS-PAGE

Focalizao Isoeltrica:
Gel com gradiente de pH imobilizado As molculas migram atravs do gel at atingirem o ponto isoeltrico (ponto no qual a sua carga igual a zero)

TCNICAS DA PROTEMICA
o Eletroforese bidimensional (2D)
SDS-PAGE:

Eletroforese em direo perpendicular IEF, em gel SDS-PAGE dodecil sulfato de sdio

As molculas so separadas de acordo com a sua massa molecular

TCNICAS DA PROTEMICA
o Eletroforese bidimensional (2D)
Eletroforese 1D bandas Eletroforese 2D spots proteicos Corados com Azul de Coomassie, Nitrato de prata e outros corantes comerciais

No caso de 2-DE, podem ser visualizados entre 100 a 2000 pontos (spots), cada um contendo protena(s). Podem ser detetadas modificaes ps-traducionais na forma de uma linhagem de spots no eixo horizontal ou vertical. A partir de ferramentas de informtica, o material de fundo (background) subtrado, os spots comparados e os dados normalizados e analisados estatisticamente para a quantificao de volumes proteicos ou intensidades.

TCNICAS DA PROTEMICA
o Eletroforese bidimensional (2D)
Vantagens:
Possui uma boa resoluo

Desvantagens:
Presena de protenas em elevadas

concentraes, o que dificulta a migrao eletrofortica das menos abundantes

Fornece informaes acerca das

protenas, tais como as modificaes pstraducionais

Dificuldade na extrao de protenas

intactas do gel para posterior anlise topdown

Limitado pelo range de pH

TCNICAS DA PROTEMICA
o Fracionamento por Cromatografia Lquida e identificao por Espectroscopia de Massa Cromatografia Lquida (IC):
O analito dissolvido numa fase lquida sem interagir quimicamente com a mesma A fase lquida contacta com uma fase estacionria, geralmente empacotada em colunas

Aps a caracterizao por massa molecular e purificados ou fracionados por cromatografia, os analitos ainda necessitam de ser identificados
Espectroscopia de massa

TCNICAS DA PROTEMICA

Espectroscopia de massa:
Consiste na ionizao de um composto e na avaliao da razo massa/carga (m/z) dos ies Composto por uma fonte de ionizao, um ou mais analisadores de massas e um detetor

TCNICAS DA PROTEMICA
o Mtodos de Ionizao
Atualmente, existem 2 mtodos principais de

ionizao utilizados na Protemica: MALDI - Empregue em amostras no estado slido ESI - Empregue em amostras no estado lquido

TCNICAS DA PROTEMICA
o Tipos de analisadores
TOF - O detetor converte o sinal da passagem do io em sinal analgico, que lido e interpretado por um computador. O resultado final traduz-se num grfico de m/z vs intensidade inica. Quadrupolo - Apresenta um conjunto de 4 eltrodos em basto que funcionam como filtros de massas. Entre os eltrodos, existe um campo eltrico que assegura que somente os ies de uma certa m/z sigam a trajetria at ao detetor. Ion trap - Filtram e aprisionam, num campo eltrico tridimensional, os ies de interesse, que so gradualmente libertados, de acordo com a m/z crescente.

TCNICAS DA PROTEMICA
o Identificao de protenas
Determinao da m/z do pptido intacto Os pptidos mais abundantes so selecionados e submetidos fragmentao por coliso a partir de um gs inerte (CID) ou por transferncia de eletres (ETD) A fragmentao do pptido ocorre entre o O do grupo carbonilo e o N da amida, o que gera 2 grupos de ies designados y e b

A avaliao dos fragmentos obtidos com tamanhos crescentes a partir do N terminal (srie b) ou C terminal (srie y) permite a deduo da sequncia do pptido, sendo possvel a identificao da protena.

APLICAES
A anlise do proteoma incompleta em: Clulas simples, principalmente em relao a protenas de baixa abundncia (recetores, transdutores de sinal e reguladores) Clulas bsicas e hidrfobas; Clulas de membrana; Clulas com massa molecular acima de 150kDa ou abaixo de 10 kDa. Quais so os benefcios dos estudos protemicos para o controlo de doenas humanas? Caracterizao parcial de protenas de diferentes tecidos; Caracterizao parcial de condies; Caracterizao parcial de subproteomas (ex. fosfoproteinas41 e o de glicoproteinas42). No so facilmente identificados por abordagens protemicas, sendo que as anlises de determinadas doenas do resultados semelhantes.

Biomarcadores especficos e sensveis

Cancro da cabea e pescoo; Cancro da mama; Cancro do colon; Cancro do ovrio.

APLICAES

Os tecidos afetados pela maioria das doenas humanas no so de fcil acesso, e por isso, no so utilizados nas anlises de rotina.

Limitao da anlise: resoluo Heterogeneidade celular

Microdissecao por laser

identifica m

resolu o

Fluidos corporais

Nmero reduzido de clulas Manuseio extra da Protenas libertadas no amostra. Diagnstico sangue por tecidos doentes

problema

APLICAES
Problemas da utilizao de fluidos corporais: Complexidade do material biolgico; Caracterstica dinmica da composio proteica; Necessidade de analisar um grande nmero de indivduos para determinar a variabilidade intra e interindividual de um potencial marcador; No desenvolvimento de testes clnicos, um marcador isolado dificilmente ter sensibilidade e especificidade suficiente para se proceder a um diagnstico necessrio um painel de protenas associadas a condies especficas.

Exemplos de fluidos corporais que diagnosticam determinadas doenas: Urina doena de Anderson-Fabry; Lquido cefalorraquidiano esclerose mltipla e esclerose lateral amiotrfica, doena de Alzheimer, Creutzfeldt-Jakob e Parkinson; Lquido broncoalveolar doena pulmonar obstrutiva crnica; Lquido sinovial osteoartitre; Lgrima ceratocone; Aspirado mamilar cancro da mama.

BIBLIOGRAFIA
BARBOSA, Eduardo; VIDOTTO, Alessandra; POLACHINI, Giovana; HENRIQUES, Tiago; TROV DE

MARQUI, Alessandra; TRAJARA, Eloiza. Protemica: metodologias e aplicaes no estudo de doenas humanas. Elsevier Editora Ltda, 2012.