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LE RISPOSTE DELLORGANISMO Lecotossicologia si basa sullindividuazione di risposte, spesso inducibili, che lorganismo attiva con lo scopo di proteggersi dalleffetto

avverso delle sostanze tossiche.

Bioaccumulo Alla base delle nuove Leggi Quadro che regolano questa materia (Decreto Legislativo 152/06; Direttiva Quadro 2000/600/CE) vi la necessit di impostare con un approccio integrato le attivit di monitoraggio e controllo per la tutela qualitativa e quantitativa delle acque e di considerare i corpi idrici come sistemi complessi costituiti sia da componenti abiotici (acqua e sedimenti) sia da componenti biotici (gli ecosistemi acquatici e terrestri ad essi associati). Queste norme prevedono che la valutazione dello stato ambientale delle diverse tipologie di acque si basi non solo sulle analisi chimiche e fisiche delle acque, ma anche sulla risposta di prove mirate a valutare la tossicit e bioaccumulabilit (esposizioni a 28 giorni) degli inquinanti pericolosi. La determinazione del bioaccumulo fornisce unindicazione media, nel tempo, dei livelli di contaminazione raggiunta nellambiente, favorendo lindividuazione degli inquinanti, come ad esempio i metalli pesanti, che pur mostrando concentrazioni basse nellacqua e/o nei sedimenti, tendono ad accumularsi in modo significativo nel biota. A fronte di queste esigenze normative si deve constatare che i test di tossicit e di bioaccumulo non costituiscono sempre una pratica diffusa nelle strutture tecniche dedicate ai controlli e al monitoraggio, ma spesso richiedono ancora approfondimenti e soprattutto devono essere standardizzati per qualificare i risultati delle prove.

Ecotossicologia ed Ittiotossicologia LEcotossicologia acquatica la scienza che studia gli effetti di sostanze di diversa origine sugli organismi acquatici. Quando lo studio viene applicato a specie ittiche, si parla in modo pi specifico di "Ittiotossicologia". Si definisce "tossica" una qualsiasi sostanza in grado di produrre una risposta in un determinato sistema biologico, danneggiandone la struttura o funzione, o provocandone la morte. Gli effetti tossici si manifestano negli organismi bersaglio in modi diversi (effetti letali e subletali); tali modi possono dipendere dal tipo di sostanza, dalla specie interessata, nonch ancora da esposizione e concentrazione. Un test di tossicit una procedura che consiste nel sottoporre una o pi specie (animali o vegetali), in condizioni sperimentali controllate e per un tempo determinato, al contatto con una o pi sostanze in concentrazione nota o incognita, allo scopo di verificare se si manifestano effetti tossici.

In funzione dei sistemi di esposizione si possono distinguere diversi tipi di test di tossicit: saggi statici, semistatici, con ricircolo, a flusso continuo; in funzione dei tempi di esposizione i test possono essere suddivisi in test a breve termine e a lungo termine. I parametri pi comunemente utilizzati per quantificare la risposta di saggi ecotossicologici sono LC50, EC50, NOEC e LOEC. Limportanza dei saggi ecotossicologici stata evidenziata da tempo e trova applicazione in diversi settori: dalle acque reflue ai percolati di discarica, dalle acque superficiali a quelle potabili, dai rifiuti tossico-nocivi alla bonifica di siti contaminati, ecc. Il Ministero dellAmbiente e della Tutela del Territorio riconosce il ruolo fondamentale dei test ecotossicologici, e in particolare di quelli che impiegano specie ittiche, fra le procedure necessarie per il riconoscimento di idoneit dei prodotti disperdenti ed assorbenti da impiegare per la bonifica dellambiente marino soprattutto dalla contaminazione di idrocarburi petroliferi.

Per biomonitoraggio si intende la rilevazione sistematica dello stato dellambiente, in relazione a fenomeni di inquinamento, ottenuta mediante la registrazione di variazioni a carico della componente biotica del sistema Dati i fenomeni di propagazione degli effetti, il biomonitoraggio pu utilizzare fenomeni osservabili a livello di organismo popolazione comunit Gli organismi usati nel biomonitoraggio sono detti bioindicatori

BIOMARKERS

pi precisamente: ..qualunque variazione biochimica, cellulare, fisiologica o comportamentale che pu essere misurata, dando evidenza di esposizione e/o effetto ad uno o pi composti inquinanti. Il ruolo del biomarker non quindi quello di dare informazioni quantitative sui livelli di esposizione di un organismo, ma di fornire indicazioni sul suo stato di salute

BIOMARKERS I biomarkers possono essere: di esposizione e di effetto I BIOMARKERS DI ESPOSIZIONE sono risposte attive per lo pi basate sui sistemi di detossificazione o metabolizzazione. Forniscono informazioni sul tipo di inquinanti cui lorganismo esposto e sulla loro biodisponibilit. Indicano che lorganismo stato esposto a particolari categorie di sostanze. Non misurano un danno biologico Non indicano se effettivamente ci sia stato un danno dovuto allesposizione Indicano che una certa categoria di sostanze presente e biodisponibile nellambiente ed potenzialmente in grado di determinare un danno, senza per questo dare indicazione su reali effetti tossicologici Esempi - ioni metallici bivalenti metallotioneine - composti organici idrofobi a PM < 800 monoossigenasi microsomiale (citocromo P450)

I BIOMARKERS DI EFFETTO sono risposte che denotano uno stato di sofferenza funzionale. Non ci informano necessariamente sulla natura chimica dellinquinante ma tuttavia evidenziano il danno subito dallorganismo. Sono importanti per il loro carattere predittivo (es. danni al DNA) Indicano la presenza di un danno biologico e permettono di quantificarlo Alcuni sono estremamente specifici, permettendo di risalire alla causa -inibizione di ALAD effetto dovuto unicamente al piombo -inibizione AchE da parte di carbammati e organofosforici Altri sono molto generici: - riduzione SFG, lesioni epatiche, disordini immunitari, certi danni al DNA - proteine di stress, stabilit lisosomiale (effetto dovuto a molte sostanze diverse, ma anche a situazioni di stress diverse come anossia e shock termico)

ESEMPIO: BIOMARKERS A LIVELLO PROTEICO INDUZIONE DELLE METALLOTIONEINE (esposizione)

Si tratta di proteine citoplasmatiche a basso peso molecolare, monomeriche e dimeriche, termostabili, caratterizzate da un alto contenuto di cisteina, e quindi ricche di gruppi SH. Questo le rende ottimi agenti chelanti. Struttura aminoacidica molto conservata, con similitudini maggiori tra specie evolutivamente pi vicine; presenti comunque in modo diffuso, sia tra vertebrati che invertebrati
Inquinante: metalli pesanti In particolare chelano metalli come Ag, Cd, Cu, Hg, Zn, che sono legati allinterno di clusters con chiralit opposta Ruolo fisiologico legato alla regolazione intracellulare di metalli essenziali (Zn, Cu)

Sono inducibili, quindi la loro concentrazione in rapporto con la quantit di metallo I vari tipi di metallotioneine sono specifici per i singoli metalli Biomarker di esposizione, permette di inferire sulla presenza di metalli nellecosistema e la loro biodisponibilit, non necessariamente sulleffetto tossico di questa esposizione per lorganismo

Strumento che in questi anni si rivelato utile e versatile, quindi molto utilizzato Porre comunque attenzione al fatto che: -la presenza delle metallotioneine presenta fluttuazioni stagionali dovute al ciclo riproduttivo -presenza e induzione influenzata da glucocorticoidi (ormoni da stress, prodotti dal surrene), condizioni di stress, ipossia, basse temperature

Biotrasformazione dei metalli

Metalli nella tavola periodica


H Li Na K Rb Cs Fr Be Mg Ca Sr Ba Ra Sc Y La Ac Ti Zr Hf Rf V Nb Ta Ha Cr Mo W Mn Tc Re Fe Ru Os Co Rh Ir Ni Pd Pt Cu Ag Au Zn Cd Hg B Al Ga In Tl C Si Ge Sn Pb N P As Sb Bi O S Se Te Po F Cl Br I At He Ne Ar Kr Xe Rn

Ce
Th

Pr
Pa

Nd
U

Pm
Np

Sm
Pu

Eu
Am

Gd
Cm

Tb
Bk

Dy
Cf

Ho
Es

Er
Fm

Tm
Md

Yb
No

Lu
Lr

Metalli tossici Metalli alcalini e alcalino- terrosi Altri metalli

Anfoteri Gas nobili Altri elementi

Tossicit dei metalli


I metalli non sono biodegradabili. La loro tossicit dovuta a:
legame con molecole nellorganismo che ne alterino le funzione, interferenza con acquisizione di metalli essenziali, rimpiazzare i metalli essenziali nelle proteine in modo da alterarne le funzioni.

Il rischio associato ai metalli dovuto alla loro tossicit ed alla loro capacit di entrare nellorganismo.

Tossicit dei metalli


I metalli pi tossici sono:

Alghe

Hg > Cu > Cd > Fe > Cr

Piante
Policheti Mammiferi

Hg > Pb > Cu > Cd > Cr


Hg > Cu > Zn > Pb > Cd Ag > Hg > Tl > Cd > Cu

Assorbimento ed internalizzazione
Solubilit nella fase lipidica dei composti organometallici: CH3Hg, (C2H5)4Pb. Trasporto attraverso sistemi di trasporto di altri metalli (Cd++ e Hg++ per Ca++) o specifici.

Metallotioneine

Le metallotioneine (MT) sono peptidi e proteine ubiquitarie a basso peso molecolare ad alto contenuto in aminoacidi solforati e metalli. Si ipotizza che giochino un ruolo:
nella fissazione dei metalli in tracce (Zn++, Cu++), nel controllare la concentrazione di questi ioni, nella regolazione dei flussi degli ioni ai distretti cellulari, nella neutralizzazione dei metalli tossici (Cd++, Hg++) e nella protezione dallo stress indotto dai metalli.

Metallotioneine

Distribuzione
Le metallotioneine sono presenti in tutti gli organismi: animali, vegetali e microrganismi. Negli animali queste proteine posseggono polimorfismo genetico e sono abbondanti nei tessuti parenchimali (fegato, rene, pancreas e intestino). La loro concentrazione dipende da specie, tessuto, et, sesso ed altri fattori non ancora completamente identificati Nonostante che le metallotioneine siano proteine citoplasmatiche si sono trovate accumulate nei lisosomi e nel nucleo.

Classificazione
Il nome deriva dal fatto che hanno un alto contenuto di zolfo e metalli. Tale contenuto varia a secondo del metallo (fino ad oltre il 20% in peso) Nei mammiferi sono caratterizzate da un peso molecolare di 6000-7000 Da, contengono da 60 ad 68 amino acidi di cui 20 Cys che legano 7 equivalenti di ione metallico bivalente. Mancano di aminoacidi aromatici. Tutte le Cys sono in forma ridotta e sono coordinate con ioni metallici.

Classificazione Le metallotioneine
La superfamiglia delle the metallotioneine definita come quella che comprende i peptidi che assomigliano alla metallotioneina renale equina che ha le seguenti caratteristiche:
Basso peso molecolare Composizione:
Alto contenuto in Cys, basso contenuto in aromatici. Sequenza caratteristica.

Classificazione Le famiglie
Una famiglia di metallotioneine caratterizzata da una particolare sequenza ed legata ad una o pi specie.
I membri di una determinata famiglia appartengono solo a quella e si pensa siano correlati da un punto di vista evoluzionistico Ogni famiglia identificata da un numero e dalla specie. Per esempio: Famiglia 1: vertebrati.

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Classificazione
Le sottofamiglie
Si definiscono sottofamiglie di metallotioneine quegli insiemi di proteine che oltre i caratteri propri delle famiglie condividono un insieme di caratteri pi stringenti. Per esempio: m1, m2

I sottogruppi
Un sottogruppo rappresenta un insieme di sequenza correlate filogeneticamente. In un albero filogenetico rappresentano un ramo. Per esempio: m2U2 = MT-2 di ungulati, sottogruppo della sottofamiglia m2.

Le isoforme
Sono i membri di sottogruppi, sottofamiglie e famiglie. Per esempio MT-1E umana.

Classificazione I clan
Un clan un insieme di proteine che dividono delle caratteristiche non gi definite:
Struttura, Propriet termodinamiche, Affinit per i metalli Propriet funzionali

Struttura
Nonostante che le sequenze aminoacidiche siano diverse hanno caratteristiche strutturali simili:
Forma a manubrio, Due domini, Diverse unit tetraedriche Me(II)-Cys, Tutte le Cys coinvolte nel legame con lo ione metallico Pressoch assente la struttura secondaria.

Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae (1AQR)

Cu-Metallotioneina da Saccharomyces Cerevisiae (1AQR)

Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunit a (1QJH)

Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunit a (1QJH)

Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunit b (1QJL)

Cd-Metallotioneina da Riccio di mare Subunit b (1QJL)

Cd-Metallotioneina umana (1MHU)

Cd-Metallotioneina umana (1MHU)

Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)

Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)

Cd-Metallotioneina di Callinectes sapidus (1DMF)

- PROTEINE DA STRESS Proteine citosoliche, aumentano in presenza di stress di varia natura, chimici, fisici, fisiologici Si tratta di biomarkers generali di effetto, utili per valutare se lorganismo esposto o meno a situazioni di stress Misurate con tecniche immunochimiche o elettroforetiche

Le heat shock proteins (hsp) sono state individuate per la prima volta come risposta a temperature elevate. La loro sintesi viene indotta dai danni generati da diversi fattori di stress, tra cui le sostanze tossiche. Molte sostanze sono infatti caratterizzate da proteotossicit, cio capacit di denaturare le proteine Si tratta di un gruppo eterogeneo che comprende molte famiglie, in genere indicate con una sigla che ne indica il peso molecolare es: hsp60 (PM: 60 000), hsp70 (PM: 70 000), hsp90

INDUCIBILITA Induzione delle hsp70 In presenza di proteine denaturate le hsp70 si legano alle catene peptidiche non ripiegate liberano la heat shock factor protein (hsf), cui normalmente sono legate lhsf, liberato dalla hsp, va a legarsi a una regione del DNA detta heat shock element (hse) viene attivata la sintesi di mRNA per le hsp70

Rat Hsp70 Protein Binding Domain (1ckr)

Human Hsp70 ATP Binding Domain (1s3x)

Le sostanze xenobiotiche possono agire direttamente nella sede di ingresso o possono avere effetti a distanza su altri organi e tessuti, se in grado di attraversare la pelle, le mucose di rivestimento del tratto gastrointestinale o delle vie respiratorie

Diffusione passiva Trasporto attivo

La capacit di assorbimento dei diversi tessuti pu influenzare in modo significativo il destino della sostanza nellorganismo, che pu poi penetrare e diffondersi nel torrente circolatorio attraverso le pareti vascolari

Distribuzione non uniforme


Bioaccumulo:

(barriera ematoencefalica, placentare, organi poco irrorati ecc.) Fegato e tessuto adiposo Tessuto osseo (metalli pesanti)

La funzione delle reazioni di biotrasformazione quella di aumentare la idrosolubilit degli xenobiotici, evitandone laccumulo negli organismi favorendone lescrezione in

ambiente acquoso

LE REAZIONI DI BIOTRASFORMAZIONE COMPRENDONO:

Reazioni di tipo I o di trasformazione (funzionalizzazione) Reazioni di tipo II o di coniugazione

Reazioni di fase I: inseriscono o smascherano gruppi funzionali (-OH, NH2 - COOH)

Introducono gruppi funzionali in molecole apolari oppure Trasformano gruppi funzionali presenti nelle sostanze estranee Tali reazioni aumentano la polarit della molecola portando spesso ad una diminuzione dellattivit biologica e/o della tossicit

Le reazioni di ossidrilazione sono catalizzate da enzimi detti monoossigenasi (ossidasi a funzione mista) contenenti il citocromo P-450

RH+O2+NADPH+H+ --> ROH+H2O+NADP+

Il citocromo P450
Il P450 una famiglia multigenica di emoproteine che catalizzano la monoossigenazione di substrati endogeni ed esogeni

CYP 2 E 1
Cytochrome P450 Gene family

Gene number

Gene subfamily

Same gene family : sequence similarity >40% Same subfamily : sequence similarity >55%

Il citocromo P450
Tali enzimi hanno in genere ampia specificit, potendo agire su molti composti diversi e possono essere indotti dai substrati stessi

Caratteristiche genetiche : polimorfismo

I membri delle famiglie CYP1, CYP2 e CYP3 sono quelli pi interessati al metabolismo degli xenobiotici

Le caratteristiche di substrato specificit ed inducibilit dei citocromi P450, ovvero la loro espressione solo in presenza di un determinato substrato, rendono gli enzimi appartenenti a questa famiglia dei buoni indicatori della presenza di inquinanti xenobiotici nellambiente, e ne consentono quindi lutilizzo come biomarkers. Le isoforme pi utilizzate nella rivelazione di inquinanti delle acque sono quelle appartenenti alla famiglia CYP1 nel fegato dei pesci, che risultano indotte dalle classi pi diffuse di contaminanti, come gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA), gli idrocarburi poliaromatici nitrati (NPAH), i policlorobifenili (PCB), le diossine (TCDD) ed alcuni pesticidi. Lutilizzo del citocromo P450 come biomarker presenta il vantaggio di poter abbassare il limite di concentrazione di inquinante rilevabile rispetto alle tecniche analitiche tradizionali, e consente inoltre di ottenere una risposta integrata nel tempo e nello spazio dellesposizione dellorganismo bioindicatore al contaminante. Poich leffetto del contaminante pu essere individuato anche in dosi subletali, prima della comparsa di danni irrimediabili agli organismi ed allecosistema, la variazione dei livelli di citocromo P450 pu rappresentare un primo campanello dallarme di una necessit di intervento di risanamento del sito esaminato.

Linduzione del citocromo P450 pu essere determinata indirettamente attraverso saggi di attivit di altri enzimi appartenenti al sistema delle monoossigenasi a funzione mista, ed il pi utilizzato a questo fine nei pesci la 7-etossiresorufina-O-dietilasi (EROD), che catalizza lidrolisi delletossiresorufina a 7-idrossiresorufina, un composto la cui fluorescenza rilevabile attraverso analisi spettrofluorimetriche di fluorescenza. La metodica di rilevamento fluorimetrica accettata come standard ISO per la valutazione dellinquinamento delle acque da TCDD, PAH e PCB, ma anche possibile rilevare direttamente il citocromo P450 mediante test immunologici come lELISA utilizzando anticorpi specifici per lisoforma CYP1A.