Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco

Carrera Profesional de Farmacia y Bioqumica

cromatografa
Mtodo usado principalmente para la separacin de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es mvil. La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido soportado en un slido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una pelcula, etc...

La velocidad de desplazamiento es funcin del coeficiente de distribucin de cada componente entre las dos fases.

[A ]FE D= [A ]FM

FE slido

FM gas

lquido
gel

lquido
fluido sc

CROMATOGRAFA

Separacin

Determinacin

la naturaleza de las fases mvil y estacionaria y la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, es decir, el mecanismo de interaccin

dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la estacionaria

Informacin analtica relativa a la muestra

Representacin grfica de la respuesta del detector en funcin del tiempo, volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatogrfico

funcionamiento del sistema cromatogrfico

intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es insertado al principio del lecho cromatogrfico hasta que sale del mismo el tiempo que tarda el mximo de un pico en ser eluido despus de la inyeccin

t0

tR

tR

t'R = tR - to

diferencia entre el tiempo de retencin del analito y el volumen muerto de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna comparado con un compuesto no retenido

k' = ( tR - to ) / to

Es la relacin entre el tiempo que las molculas del analito estn en la fase estacionaria y el que estn en la fase mvil.

CS VS tiempo que el soluto pasa en la FE K tiempo que el soluto pasa en la FM C m Vm

K'= KD K'= D

tR = t0 (1 + K')

Pes y Pm, probabilidades que tiene un analito de estar en la FE o FM, respectivamente, coinciden con las fracciones del mismo en cada una de estas fases: Pes = K'/ 1+K' Pm es equivalente al denominado factor de retraso, R,

Pm = 1/ 1+K'

R = velocidad de desplazamiento del analito/velocidad de FM = 1 / 1+K'

volumen que ocupa en la columna la FM

V0 = t0F
volumen de FM necesario para que se produzca la elucin de un soluto

V= tF

VR = tRF V'R = t'RF K' = V'R/V'0 VR = V'R + V0 VR = V0 (1 + K')

CROMATOGRAFA EN SUPERFICIE PLANA

CMARA CROMATOGRFICA

FLUJO propiciado por CAPILARIDAD

FASE MVIL (apolar)

Rf=

distancia avanzada por la molcula

distancia avanzada por el frente

Rf es caracterstico para cada soluto para una composicin dada de fase mvil y un determinado tipo de superficie

CROMATOGRAFA EN PAPEL
CLASE: Reparto PROPIEDAD: Solubilidad NOMBRE: Fase Normal SOPORTE celulosa de papel de filtro F. ESTACIONARIA (LQUIDA) H2O absorbida en la celulosa. F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

Molec. Hidroflica LENTA Retenida por f.estacionaria

Molec. Hidrofbica RPIDA Disuelta en f. mvil

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)

CLASE: Interaccin PROPIEDAD: Hidrofbica NOMBRE: Interaccin Hidrofbica SOPORTE plancha de metal o vidrio F. ESTACIONARIA (SLIDA) slido pulverizado sobre plancha de metal o vidrio. El ms usado es el gel de slica.

F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

Molec. Hidroflica LENTA Retenida por f.estacionaria

Molec. Hidrofbica RPIDA Disuelta en f. mvil

CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN

CLASE: Reparto PROPIEDAD: Tamao (y forma) NOMBRE: Exclusin SOPORTE Resina de micropartculas esfricas formadas por polmeros hidroflicos (dextrano, agarosa poliacrilamida o mezcla de ellos). Tamaos de poro intrvalo o rango de fraccionamiento. P.e. Sephadex G25: Sephadex G200: 1000 5000 Da 5000 250000 Da
F. ESTACIONARIA MICROPARTCULAS

FASE MVIL

F. ESTACIONARIA (LQUIDA) solvente acuoso (el mismo que el de la fase mvil) que se encuentra dentro de micropartculas. F. MVIL (LQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartculas).

CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN

Molec. GRANDES RPIDAS
* Avanzan con mayor velocidad a travs de los espacios intersticiales (con F. mvil) Molec. PEQUEAS LENTAS * Son retenidas por las fibras de las micropartculas y avanzan con menos velocidad (con F. estacionaria). PERFIL DE ELUCIN
APLICACIN MUESTRA
respuesta del detector

grande

pequea

ELUCIN

8 9 fraccin

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

CLASE: Interaccin PROPIEDAD: Electrosttica NOMBRE: Intercambio inico (aninico o catinico) SOPORTE Resina de micropartculas formadas por polmeros sintticos (poliestireno entrecruzado con divinilbenceno o DowexR) o matrices de polmeros naturales (dextranos, celulosas, agarosa). F. ESTACIONARIA (SLIDA) Grupos con cargas inicas unidos al soporte. Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-). Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+). F. MOVIL (LQUIDA) Solvente que anula la interaccin electrosttica. 2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga de las molculas de la muestra. Gradientes inicos competencia por grupos electrfilos.

FASE MVIL

F. ESTACIONARIA MICROPARTCULAS

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Gradiente de pH Gradiente salino

Molec. MENOR CARGA (+) RPIDAS

* Son desplazadas ms fcilmente por la f.mvil. Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS * Son retenidas por los grupos cargados inicamente de la f. estacionaria. PERFIL DE ELUCIN

respuesta del detector

APLICACIN MUESTRA

q+

Q+

+ Na+ -

ELUCIN

8 9 fraccin

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
CLASE: Interaccin PROPIEDAD: Interacciones especficas entre dos molculas P.e. hormona-receptor protena-metal o cofactores como ATP antgeno-anticuerpo
NOMBRE: Afinidad biolgica SOPORTE Matriz de micropartculas hidroflicas sin carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrlica). F. ESTACIONARIA (SLIDA) Ligando especfico unido a la matriz. -- Comerciales: Concavalina A une glicoprotenas Protena A une IgG (anticuerpos) -- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz F. MVIL (LQUIDA) Solucin que anula o disminuye la afinidad con el ligando de la fase estacionaria. -- Solucin con el propio ligando Molcula + ligando libre -- Solucin con algo que interacciona con el ligando - Molcula
FASE MVIL

F. ESTACIONARIA MICROPARTCULAS

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIN RPIDAS * No se unen al ligando de la fase estacionaria. Molec. INTERACCIN LENTAS * Se unen al ligando de la f. estacionaria. Elucin especfica. PERFIL DE ELUCIN
LAVADO respuesta del detector ELUCIN ESPECFICA

molcula

APLICACIN MUESTRA LAVADO ELUCIN ESPECFICA

8 9 fraccin

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Sistema GST (Glutatin-S-Transferasa)
GST
Protena X
Purificacin de PROTENAS RECOMBINANTES Cualquier protena con etiqueta GST

ELUCIN

Glut

Glut GST

Glut

APLICACIN MUESTRA

Glut GST