CROMATOGRAFA

Tcnica que permite separar o Purificar los componentes de una mezcla de substancias biolgicas y su posterior deteccin.

fase mvil fase estacionaria

Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin .

detector

El orden aproximado de elucin de compuestos es aproximadamente el que se indica

y la polaridad de los disolventes se recoge en el grfico de la izquierda

Historia
El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 18721919) - tambin conocido por su nombre latinizado, Tiselius emple por primera vez en 1906 el trmino "cromatografa" (que proviene del griego chroma y graphein que significan a su vez respectivamente "color" y "escribir"). A comienzos del ao 1903, Mikhail Tswett us columnas de adsorcin de lquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacan pasar a travs de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido da un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que stos se separaban en distintas bandas a lo largo de la columna. Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) comenz a desarrollarse en los aos 1960, aumentando su importancia en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica cromatogrfica ms empleada. Sin embargo esto se ira modificando con el paso de los aos.

Clasificacin
Cromatografa plana

Cromatografa en capa fina

Cromatografa de gases Cromatografa lquida en fase inversa Cromatografa lquida en fase normal Cromatografa lquida de intercambio inico Cromatografa lquida de exclusin Cromatografa lquida de adsorcin Gas (f. movil) Lquido (polar) Lquido (menos polar) Lquido (polar) Lquido Lquido Lquido Slido o lquido Slido o lquido (menos polar) Slido o lquido (polar) Slido Slido Slido Slido

Cromatografa de fluidos supercrticos

Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son:

La cromatografa en papel es un proceso

muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento.

 La fase estacionaria esta constituida simplemente por

una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colcando pequeas gotas de la solucin y evaporando el solvente. Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografia eficaz: la escogencia del solvente y la del papel de filtro.

 La cromatografa en capa fina, o ms comnmente

TLC (thin layer chromatography, en ingls), es una tcnica cromatogrfica utilizada, entre otros posibles usos, para separar los componentes puros que forman parte de una mezcla.
Esta separacin se consigue mediante la diferencia

entre las fuerzas de adhesin de las molculas de los componentes a una fase mvil (normalmente, un disolvente) y a una fase estacionaria (la llamada capa fina, que puede ser papel o gel de slice). Esta diferencia se traduce en un mayor o menor desplazamiento o movilidad de cada componente individual, lo cual permite su separacin e identificacin.

 Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: La Cromatografa de lquidos es una tcnica ampliamente utilizada que permite separar fsicamente y cuantificar los distintos componentes de una solucin. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido. Las sustancias que permanecen ms tiempo, libres en la fase mvil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es el principio fundamental de la cromatografa.

Mtodos de cromatografa lquida

Mtodo Lquido, slido o de adsorcin Lquido Fase enlazada Pares de iones Intercambio inico Exclusin estrica Afinidad Abrev iatura LSC LLC BPC IPC IEC Mecanismo predominante Adsorcin sobre la superficie

Reparto entre fases lquidas, una mvil y la otra estacionaria.

Reparto y / o adsorcin entre las fases mvil y enlazada. Separacin de pares de iones entre las fases mvil y enlazada. Uso de la carga por adsorcin sobre un sitio inico fijo por medio de intercambio de cationes o de aniones. Aprovechamiento del tamao de las molculas por su difusin dentro de poros de tamao adecuado. Uso de la estructura de ligantes inmovilizados para unir bioselectivamente la protena deseada.

EC
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Seleccin de un mtodo de cromatografa lquida El conocimiento de la estructura molecular de los componentes de la muestra puede ser muy til en la seleccin de un mtodo de cromatografa lquida.

Cromatografa de gases
La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte.

oCromatografa de fluidos supercrticos

La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una tcnica hbrida entre la cromatografa de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas tcnicas. Esta tcnica es importante porque permite la separacin de mezclas en las que no es adecuada la aplicacin de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos no voltiles o trmicamente inestables que no pueden ser separados mendiante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su deteccin en HPLC.

Cromatografa de Capa Fina

Fundamentos. La separacin de mezclas de molculas mediante la cromatografa de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es inmicible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra. Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil "lavar" a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. Para ilustrar esto, supongamos que tenemos una serie de vasos de precipitado llenos con agua hasta la mitad.

Se aade al primero de los vasos una mezcla de las molculas A y B. A posee una Kr(hexano:agua) de 0.9, en tanto que la Kr de B es 0.1. A continuacin se aade un volumen de hexano al primer vaso, se agita, se permite la separacin de las fases y se recupera dicho hexano. El hexno recuperado en este primer vaso se aade al segundo y se aade ms hexno limpio al primer vaso. Ambos se agitan, se dejan separar las fases y se recupera el hexano. El hexano del segundo vaso se pasa al tercero el del primero al segundo y se anade hexano nuevo al primer vaso. Este procedimiento se repite hasta que todos los vasos se llenen con hexano.

Cromatografa de Capa Fina

Proceso de Adsorcin La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la substancia con el solvente. Adsorbentes Los adsorbentes ms utilizados en la Cromatografa de Capa Fina son: Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica) Tierra Silcea Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas

Estos adsorbentes deber tener las siguientes caractersticas: Tamao de Partcula Volmen de Poro Dimetro de Poro rea Superficial Homogeneidad Pureza

Preparacin de la Placa Cromatogrfica Se usan como soporte del adsorbente lminas de: Vidrio, Plstico Metlicos (ej: Aluminio) Los tamaos de la placa para TLC convencional son : 20 cm x 20 cm; 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2 cm Hay placas que contienen un indicadorr de Fluorescencia : F254 F366. El nmero que apararece como subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado.

Aplicacin de la muestra La muestra se aplica en la placa segn el objetivo: Analtico Preparativa en: Banda Punto Mancha Desarrollo de la Placa Es un proceso mediante el cual son tranportados a travs de la fase estacionaria por la fase mvil. Eleccin del Solvente

Cmaras para Desarrollo Existen varios tipos de cmaras: Normal Doble Compartimiento Sandwich Horizontal Vario KS U

Deteccin Visualizacin Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de mtodos que nos permitan visualizar el(los) componente(s) presentes. Tambin se conoce este procedimiento como Revelado. Estos mtodos son: Qumicos (por inmersin o rociado). Se obtienen derivados coloreados o fluorescentes Fsicos (pticos). Generalmente se utiliza radiacin UV Evaluacin de un Cromatograma de Capa Fina

Anlisis Cualitativo Medida de Rf Comparacin Visual de Color/Intensidad Propiedades UV/IR/MS/NMR Anlisis Cuantitativo Semi-cuantitativo Comparacin visual del dimetro y la intensidad del color de la mancha contra una serie de manchas patrones de concentracin conocida Cuantitativo Indirecta Directa Densitometra Medida de Transmisin. Medida de luz transmitida a travs de la substancia. Medida de Emisin. Medida de luz reflejada desde la substancia Espectrofotometra Fluorescencia

Cromatografa de Capa Fina (Thin Layer Chromatography) La cromatografa en capa fina, o ms

comnmente TLC (thin layer chromatography, en ingls), es una tcnica cromatogrfica utilizada, entre otros posibles usos, para separar los componentes puros que forman parte de una mezcla.

Esta separacin se consigue mediante la diferencia entre las fuerzas de adhesin de las molculas de los componentes a una fase mvil (normalmente, un disolvente) y a una fase estacionaria (la llamada capa fina, que puede ser papel o gel de slice). Esta diferencia se traduce en un mayor o menor desplazamiento o movilidad de cada componente individual, lo cual permite su separacin e identificacin.

Proceso de Adsorcin La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la substancia con el solvente.

Adsorbentes Los adsorbentes ms utilizados en la Cromatografa de Capa Fina son: Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica) Tierra Silcea Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas

Estos adsorbentes deber tener las siguientes caractersticas: Tamao de Partcula

Volmen de Poro Dimetro de Poro rea Superficial

Homogeneidad Pureza

Preparacin de la Placa Cromatogrfica

Se usan como soporte del adsorbente lminas de: Vidrio, Plstico Metlicos (ej: Aluminio) Los tamaos de la placa para TLC convencional son : 20 cm x 20 cm; 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2 cm Hay placas que contienen un indicador de Fluorescencia : F254 F366. El nmero que apararece como subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del

 Aplicacin de la

muestra La muestra se aplica en la placa segn el objetivo: Analtico Preparativa en: Banda Punto Mancha

Desarrollo De Las Placas

En la cubeta se pone
una tira de papel impregnada de disolvente y que cubre la parte delantera, inferior y trasera de sta, para conseguir que la atmosfera interior est saturada con el vapor del disolvente. La cubeta se cierra

Eleccin del Solvente

La eleccin del disolvente depender, naturalmente,
de la naturaleza del compuesto que se va a separar y del material en que la separacin va a llevarse a cabo. Una regla general para la eleccin del disolvente es la comparacin de la polaridad del disolvente y de la sustancia que se desea separar. Muchos de los disolventes son de naturaleza orgnica, pero a menudo se agrega muy poca cantidad de agua, pues asi los compuestos muy polares (aminocidos, azcares o compuestos fenlicos) se mueven ms lentamente; caso contrario no habria separacin en tales sistemas binarios.

Deteccin o Visualizacin
Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere
de mtodos que nos permitan visualizar el(los) componente(s) presentes. Tambin se conoce este procedimiento como Revelado. En este caso se puede hacer uso de varios mtodos. Los mtodos fsicos, que utilizan propiedades particulares de los compuestos, tales como la fluorescencia y la radiactividad, son sobradamente conocidos, pero su aplicacin es limitada, el mtodo mas generalmente usado es hacer reaccionar a las sustancias a revelar con algn agente qumico con el que formen algn compuesto coloreado.

Conservacin del Cromatograma

El espesor del vidrio y la naturaleza tan
delicada de la capa hace poco conveniente guardar los cromatogramas. La posicin de las manchas despus del revelado puede fotografiarse o dibujarse, pero esto es pesado y exige bastante tiempo. Un mtodo mas conveniente es el pulverizado de la capa con una dispersin de un plstico transparente especial que la endurezca y permita observar el cromatograma. La pelcula flexible que resulta de la capa se retira de la capa de