Disciplina de Biotecnologia do Curso Superior Qumica Industrial IFG

Transformao de laranja visando resistncia ao cancro ctrico usando genes de peptdeos antibacterianos
Discentes:
Docente:

 O Brasil o maior produtor mundial de laranja, com 355

milhes de caixas produzidas em 2000/01, o que corresponde cerca de 30% da produo mundial. responsvel por metade da produo mundial de suco concentrado.

 A citricultura nacional apresenta vrios problemas

fitossanitrios, entre os quais se destacam: A larva minadora dos citros (Phyllocnistis citrella) A pinta preta (Guignardia citricarpa)


Clorose variegada dos citros (CVC, Xyllela fastidiosa)
Cancro ctrico (Xantomanas axonopodis)


Essa doena afeta toda a parte aera da planta, causando leses em frutos, folhas e ramos. As portas de entrada para a bactria do cancro ctrico so ferimentos em folhas causados pelo vento ou pelo ataque da larva minadora dos citros.


O controle do cancro ctrico tem sido realizado atravs de medidas para prevenir a introduo da bactria e da erradicao das plantas contaminadas.


O desenvolvimento de variedades ctricas agronomicamente aceitveis com adequado nvel de resistncia, ainda a forma mais econmica e eficiente de controlar o cancro ctrico. Grande parte das espcies apresenta poliembrionia e longo perodo juvenil.


Frente a esses problemas, a transformao gentica da laranjeira mostra-se como uma estratgia de melhoramento muito promissora

Transformao gentica de citros

Plantas transgnicas de citros j foram obtidas por meio da introduo direta de DNA em protoplastos por cocultivo de segmentos internodais ou de epictilo com Agrobacterium, e por bombardeamento de partculas em suspenses embriognicas de nucleo. Atualmente, o mtodo mais utilizado de transformao gentica em citros a transformao mediada por Agrobacterium, utilizando-se segmentos de epictilo de 1 cm como explantes. Usando esse sistema, j foram obtidas plantas transgnicas de laranja doce.

 A eficincia de transformao utilizando esse protocolo de regenerao ainda baixa:

ao pequeno nmero de brotos obtidos por explante. ao grande nmero de escapes.

As plantas transgnicas obtidas por esse sistema so juvenis, sendo necessrio vrios anos para que se possa avaliar algumas de suas caractersticas comerciais. Para contornar esse problema utilizaram interndios de plantas maduras de laranja doce cultivar Pineapple como explantes para transformao, conseguindo que as plantas transgnicas florescessem aps 14 meses.

 A falta de tcnicas adequadas de cultura de tecidos de

cultivares de laranja doce adaptados s nossas condies agroecolgicas tem dificultado o uso da tecnologia de transformao de plantas nessa cultura. Visando a minimizar esse problema, o Laboratrio de Biotecnologia Vegetal do IAPAR desenvolveu novos protocolos de regenerao de laranja doce Pra, usando segmentos finos transversais tanto de tecidos juvenis quanto de maduros. Esses novos protocolos permitem a transformao de laranja, tanto atravs de Agrobacterium tumefaciens como tambm via biobalstica. Essa metodologia foi utilizada em experimentos preliminares para a otimizao do sistema de transformao, utilizando o plasmdeo pBE2113, que contm o gene gus sob controle de promotores constitutivos.

Uso de peptdeos antibacterianos

Vrias estratgias tm sido utilizadas para aumentar a resistncia de plantas a doenas bacterianas atravs da engenharia gentica. Entre essas estratgias destacam-se:
a produo de peptdeos antibacterianos; a inibio de fatores de virulncia; o aumento das defesas naturais; morte celular programada no local da infeco;

 Todos os organismos superiores possuem sistemas de

proteo contra infeces por microorganismos. Os insetos possuem um eficiente sistema de defesa contra bactrias e outros parasitas. Esse sistema, que foi bastante estudado em Hyalophora cecropia, responsvel pela produo de peptdeos com potente atividade antitibacteriana, tais como as cecropinas. As Cecropinas pertencem a uma famlia de pequenos peptdeos, isolados da hemolinfa de insetos, que exibem atividade ltica e antibactericida contra muitas bactrias gram-positivas e gram-negativas.

 Em sua estrutura, esses peptdeos tm uma regio Nterminal bastante bsica e uma longa seqncia hidrofbica na regio C-terminal. Essas caractersticas so necessrias para a ao antibacteriana das cecropinas atravs da formao de canais nas membranas, provocando o vazamento de componentes celulares e, conseqentemente, a morte da bactria. Vrios trabalhos de transformao de espcies vegetais com peptdeos antibacterianos foram publicados nos ltimos anos. Batata e fumo foram as espcies mais utilizadas, principalmente pela facilidade de cultura de tecidos e a importncia das bacterioses.

 Montanelli& Nascari (1991) transformaram batata com um gene responsvel pela produo de cecropina e encontraram resultados positivos contra Ralstonia solanacearum em testes preliminares in vitro com extratos de plantas transgnicas. Jaynes et al. (1993), utilizando o gene Shiva-1 (um anlogo sinttico da cecropina), controlado pelo promotor do inibidor de proteinase II de batata, obtiveram alta expresso em plantas transgnicas de fumo que mostraram um aumento de resistncia a R. solanacearum.

Sarcotoxina A sarcotoxina um peptdeo antibacteriano isolado de

larvas de Sarcophaga peregrina.

Figura5.Processo de obteno de plantas transgnicas de laranja Pra apartir de tecido maduro

 Esse peptdeo possui 39 aminocidos e pertence ao grupo

das cecropinas. Em estudos in vitro, a sarcotoxina mostrou-se altamente eficiente na inibio do crescimento de algumas bactrias causadoras de doenas em plantas, especialmente para X. axonopodis pv. citri


A expresso da sarcotoxina em plantas de tabaco sob controle de um promotor constitutivo aumentou a resistncia a duas bactrias fitopatognicas: P. syringae pv. tabaci e E. Carotovora subsp. Carotovora.

 As plantas de tabaco transformadas com o gene da

sarcotoxina sob o controle de um promotor induzido por cido saliclico (PR1a) apresentaram um aumento na resistncia tanto a bactrias fitopatognicas como a fungos Rhizoctonia solani e Pythium aphanidermatum

Transformao de citros com o gene da sarcotoxina

A obteno de plantas transgnicas de laranja doce com o gene da sarcotoxina aumentar a tolerncia bactria do cancro ctrico.

 O plasmdeo utilizado para transformao (pST10) contm o gene da sarcotoxina (stx IA) ligado umpeptdeo sinal que tem a funo de exportar o peptdeo para o espao intercelular sob controle do promotor constitutivo 35S, do vrus do mosaico da couve-flor e o gene da neomicina fosfotransferase (npt II), que confere resistncia ao antibitico canamicina

Figura 6. Plantas inoculadas com isolado de X. axonopodis pv. citri (104 cfu/ml) aps 26 dias. Planta no transgnica utilizada como controle (esquerda) e planta transgnica expressando sarcotoxina (direita)

 Transformao de laranja usou a estirpe EHA-105 de Agrobacterium tumefaciens como vetor para insero do gene da sarcotoxina Interndios de mudas de laranja Pra mantidas em casa de vegetao foram utilizados como explantes iniciais. Esses interndios foram desinfestados, cortados transversalmente em segmentos de 1-2 mm e imersos em meio contendo Agrobacterium.

 Os esplantes foram ento co-cultivados por 72 horas e

transferidos para meio de induo de gemas com 200 mg/l cefotaxima, 200 mg/l timetina e 25 mg/l canamicina. Aps trs semanas no escuro, os segmentos que apresentavam gemas foram transferidos para meio de alongamento ainda com a presena de antibiticos.

 Aps 3-4 semanas no meio de alongamento, as gemas regeneradas maiores que 1 mm foram micro enxertadas em plntulas de Carrizo citrange germinadas in vitro. Quando os enxertos apresentavam de 3 a 4 folhas, pequenos segmentos de tecido foliar foram utilizados para deteco da presena do gene da sarcotoxina atravsde PCR,enxertos apresentando a banda correspondente ao gene da sarcotoxina foram ento transplantados diretamente em solo ou novamente enxertados em plantas de limo cravo em casa de vegetao

Figura 3. Construo usada nos experimentos de transformao

Figure 4. Anlise de PCR de plantas transgnicas de laranja Pra. O DNA foi isolado de folhas e amplificado com primers especficos para o gene da sarcotoxina dando um produto de 268 pb. Coluna M, marcador 100 pb; coluna C, controle negativo, laranja Pra no transformada; colunas 1-10, plantas transgnicas; coluna P, plasmdeo pST10