Pruebas bioqumicas

Diego Silva Roco Silva Nathalie Cruz Andrea Beltrn Shanath Snchez

El estudio de los microorganismos basndose en su descripcin colonial y microscpica no es suficiente para hacer una identificacin satisfactoria.

Es por esto que se tiene que recurrir al estudio de su comportamiento fisiolgico por medio de pruebas que determinan cmo utilizan los nutrimentos y qu sustancias producen.

En las pruebas bioqumicas se determina la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria puede o no transformar al crecer.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva especfica o sustrato y, despus de la incubacin del cultivo, se examina para ver los cambios qumicos que han ocurrido.

Entonces qu observamos en las pruebas bioqumicas?

O Relacin

entre caractersticas fisiolgicas y funcin celular.

O Relacin entre funciones que llevan

acabo en su ambiente natural.

O Relacin

de los metablicos microbianos.

trayectos

Principales pruebas bioqumicas

O TSI (Tiple Sugar Iron)

Identifica microorganismos que fermentan: *glucosa (superficie roja) *lactosa y/o sacarosa (tubo amarillo) Tambin identifica a los microorganismos que producen H2S.

Contiene *glucosa al 0.1% (Por eso solo se fermenta la parte superior del tubo) *Sacarosa y Lactosa al 1% (por eso cambia todo el color del tubo) *Rojo fenol Indicador de pH: amarillo debajo de 6,8 y rojo por encima de 8,2

FeSO4 Algunas bacterias pueden reducir SO4 a H2S. El hierro se combina con el H2S y forma FeS, un compuesto negro.

LIA (Lysine Iron Agar) Permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilacin o desanimacin de la lisina y si producen H2S

Prueba Prueba de H2S

Reaccin Positiva Formacin de un precipitado Fondo y superficie color prpura Superficie roja

Reaccin Negativa No hay formacin de un precipitado negro Fondo amarillo y superficie prpura Superficie prpura

Decarboxilacin de la lisina Desaminacinde la lisina

Medio SIM (Sulfure Indol Motility)

O La prueba del Indol estudia la capacidad de degradar

el triptfano con produccin de Indol y metabolitos indlicos. Esto es indicado por el reactivo de Kovac, el cual reacciona con el indol formando un color rosa. La presencia de indol indica que la bacteria produce O La prueba de sulfuro nos indica si el microorganismo produce H2S a partir de sulfatos. O La prueba de Motilidad nos dice si la bacteria se mueve a cierta temperatura. Esto lo observamos si el medio se ve turbio o si unicamente se ve la lnea donde se incub la bacteria.

O cidos y gases

Estudia la capacidad de utilizar un hidrato de carbono con la produccin de cidos y la formacin de gas. O Hidrolisis Gelatina Estudia la capacidad proteoltica del microorganismo por degradacin de la gelatina. O xido - Fermentativa o de Hugh-Leifson Estudia si el microorganismo es capaz de metabolizar un hidrato de carbono por va oxidativa o por va fermentativa

Rojo de metilo y Voges-Proskauer O Permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases:
1. La metabolizarn aerobiamente (respiracin

oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio 2. Continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de dos tipos:

O Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo

de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

O Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del

grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aergenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio el reactivo de VogesProskauer que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico.

Pruebas enzimticas
O Oxidasa

Estudia la presencia de la enzima citocromo c oxidasa que acta en la cadena respiratoria del organismo. O Catalasa Estudia si el microorganismo posee la enzima catalasa que acta descomponiendo el perxido de hidrgeno. O Coagulasa Forma cogulos formados por la reaccin de la coagulasa en un tubo de ensayo. Estudia la produccin del enzima coagulasa capaz de coagular el plasma. Ayuda a diferenciar Staphylococcus aureus de otras especies. O Ureasa La prueba de ureasa estudia si el microorganismo posee la enzima ureasa que cataliza la hidrlisis de la urea.

Prueba
UTILIZACIN DE AZCARES

Fundamento
La determinacion de la capacidad de un microorganismo para utilizar un hidrato de carbono especifico incorporado en un medio de cultivo basico, originando un pH acido. Se utiliza un indicador rojo fenol

Resultado
+: color amarillo del medio, que indica acidez. -: color rosa-rojizo del medio, que indica alcalinidad.

PRUEBA DE CATALASA

peroxido de hidrogeno se forma como un +: Inmediata formacion LA El producto terminal oxidativo de la liberacion de gas. descomposicion aerobica de los azucares. Si se deja acumular, el peroxido de hidrogeno es toxico para las bacterias, por lo que deben tener el enzima catalasa, que lo descompone a agua y oxigeno.

de burbujas por la

-: No hay formacion de burbujas.

CITRATO

Determina si un microorganismo es capaz de +: Crecimiento con un color azul intenso en utilizar citrato como unica fuente de carbono el pico de flauta. para el metabolismo. -: No se observa crecimiento ni cambio de El medio utilizado incluye citrato como unica color, apareciendo verde. fuente de carbono y fosfato amonico como fuente de nitrogeno. Las bacterias que metabolicen el citrato, tambien utilizaran el fosfato amonico, con la consiguiente alcalinizacion del medio.

la capacidad de produccion del +: Se observa la inmediata formacion de un COAGULASA EN Investigar enzima coagulasa. Actua de alguna forma precipitado macroscopico en forma de el mecanismo de coagulacion del aglutinados blancos (grumos). PORTA ("CLUMPING sobre suero provocando la transformacion de -: Se considera negativo si no se produce la fibrinogeno en fibrina, y formacion del aglutinacion en 3-4 minutos. FACTOR") coagulo.

DNAsa

Se emplea un medio de cultivo +: Al anadir el ClH, hace que el ADN cuya caracterstica principal es la existente precipite, produciendo con de poseer acido ello un enturbiamiento del medio. Es evidente que donde ya no quedaba desoxirribonucleico, con objeto ADN por la accion de la DNAsa de investigar si es hidrolizado por microbiana, el medio aparecera el microorganismo problema, en transparente. Esto sucedera en la contigua al crecimiento, caso de que posea la enzima zona indicando con ello que el desoxirribonucleasa.
microorganismo ha hidrolizado el acido nucleico.

-: El ADN no ha sido despolimerizado, con lo que precipita por el ClH en toda la placa, y no va a haber zona transparente.

HIDROLISIS ESCULINA

DE

LA La esculina, un glicosido, es
hidrolizada por algunas +: presencia de color bacterias, dando como productos negro/castano oscuro alrededor de degradacion glucosa y de las colonias. esculetina. La esculetina al reaccionar con el hierro forma un -: ausencia de color negro. complejo de color castano oscuro o negro.

PRUEBA HIDROLISIS ARGININA

DE DE

LA Se trata de detectar la hidrolisis LA de la arginina mediante la +: Color anaranjado-marron.

enzima que transforma este -: Color amarillo aminoacido en citrulina, con ausencia de color. liberacion de amoniaco. palido o

PRUEBA DE LA HIDROLISIS DE LA ARGININA GALACTOSIDASA (ONPG)

Se trata de detectar la hidrolisis de la +: Color anaranjado-marron. arginina mediante la enzima que transforma este aminoacido en citrulina, con liberacion -: Color amarillo palido o ausencia de color. de amoniaco. Fermentadores tardios de la lactosa son aquellos que degradar la lactosa en 3-4 dias. En este grupo de microorganismos podemos predecir la facultad de fermentar la lactosa +: se produce el cambio de color a amarillo. demostrando la presencia o ausencia de actividad Galactosidasa mediante el empleo del compuesto Ortonitrofenil--DGalactopiranosido (ONPG), Si se encuentran celulas positivas para la -: continua incoloro. metabolizacion activa de la lactosa, el reactivo ONPG incoloro es hidrolizado liberando un compuesto amarillo, el OrtoNitrofenol. La hipuricasa es una enzima que produce la +: Presencia de un precipitado en el fondo hidrolisis del hipurato de sodio, con la del tubo. formacion de benzoato de sodio y glicina. -: Ausencia de precipitado. Por la degradacion del triptofano se libera indol, acido piruvico, amoniaco y energia. Ese indol puede ser detectado por el empleo de determinados reactivos que dan una reaccion de color. +: Anillo de color rojo en la superficie del medio. -: Anillo del color del Reactivo de Kovacs (ocre oscuro).

HIDROLISIS DEL HIPURATO

INDOL

LECITINASA

Determinar la presencia del enzima +: Se formara un halo mas claro alrededor de lecitinasa. Para ello empleamos un medio la zona de crecimiento mi- crobiano debido a rico en lecitina, como pueda ser un medio la degradacion de la lecitina por el nutritivo enriquecido con yema de huevo. microorganismo. -: No existe halo opaco alrededor de la zona de crecimiento microbiano.

MOTILIDAD

Investigar si un microorganismo es movil o +: Aparece una turbidez que se difunde por no. Para ello se emplea un medio todo el tubo. semisolido (con Agar al 0'2%), en el que la -: Se produce una linea de crecimiento bacteria movil difunda lo ms rpidamente limitada a seguir la linea de siembra, posible. mientras que el medio que la rodea se mantiene claro.

OXIDASA

La prueba de la oxidasa esta basada en la +: Las colonias que producen citocromo presencia en la bacteria del enzima oxidasa hacen que el reactivo pase a un citocromo oxidasa. color purpura oscuro. -: No se produce cambio de color del reactivo.

ROJO DE METILO

Se trata de una prueba para detectar la +: color rojo del medio. produccion de acidos fuertes (lactico, formico y acetico) a partir de la fermentacion Se consideran rojo de metilo positivos solo -: color amarillo o cobrizo en la superficie aquellos microorganismos que puedan del medio. mantener un pH acido
Se basa simplemente en el empleo de un indicador de pH (Rojo de Metilo) para determinar la concentracion de iones Hidrogeno (pH) presentes cuando un organismo degrada la glucosa.

UREA

La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicion de los compuestos organicos. Por su accion desdobla la urea, liberando 2 moleculas de amoniaco. Empleamos un indicador de pH, el rojo fenol, con color amarillo en medio acido y rosado en medio alcalino.

+: color rojo rosado del medio, que indica alcalinizacion por el amonia- co tras el desdoblamiento de la urea. -: color amarillo anaranjado del medio.

VOGES PROSKAUER Esta prueba bioquimica permite determinar +: color rojo-rosado en la superficie la presencia de acetil-metil-carbinol en los medio (presencia de acetoina). (Prueba de la Acetoina) cultivos. Este compuesto es un producto
final neutro derivado del metabolismo de la -: no existe cambio de color. glucosa, concretamente de una fermentacion particular, denominada butileno- glicolica, la cual predomina en ciertas bacterias.

del

HIDROLISIS GELATINA

DE

LA Esta

prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para producir enzimas proteoliticas que licuan la gelatina (gelatinasas).

Cubra la placa con el reactivo precipitante de proteinas (Cloruro mercurico acido). Un precipitado blanco indica presencia de gelatina no hidrolizada; la ausencia del precipitado en la region de crecimiento bacteriano indica hidrolisis de la gelatina.

INFLUENCIA DE TEMPERATURA EN CRECIMIENTO

LA Esta prueba permite determinar temperatura optima y el rango EL temperatura de crecimiento de

microorganismo.

la Anotar el crecimiento y la abundancia de relativa del mismo. Seleccione las un temperaturas minima y maxima a la cual

UTILIZACION DE CITRATO Esta prueba permite diferenciar a las enterobacterias basandose en la COMO UNICA FUENTE DE utilizacion del citrato. Entre las ENERGIA enterobacterias citrato negativas estan

PRODUCCION NUCLEASA los reservorios de cultivo, tanto el calentado como el no calentado. TERMOESTABLE (TERMONUCLEASA) REDUCCION DE NITRATOS Esta prueba se realiza para determinar la Para determinar si el nitrato ha sido reducido capacidad de un microorganismo para a nitrito, despues de la incubacion, anadale Y DENITRIFICACION reducir los nitratos a nitritos o gas al medio de cultivo, 2 gotas de solucion A, y
nitrogeno libre, una caracteristica que a luego 2 gotas de la solucion B del reactivo de Griess y mezcle. La aparicion de una menudo tiene valor diferencial.
colo- racion rosada o roja indica que los nitratos han sido reducidos a nitritos. . Resultado positivo Resultado negativo Si la reaccion es negativa, anada una muy pequena cantidad de polvo de Zinc. La aparicion de una coloracion rosada o roja confirma la negatividad de la reaccion; en caso de que esto no suceda, significa que los nitratos han sido reducidos a N2 gaseoso, es decir se ha producido una desnitrificacion. Si la suspension se vuelve clara la prueba es positiva.

Esche- richia y Shigella y entre las citrato positivas Arizona, Citrobacter, Klebsiella, Salmonella y Serratia. DE Esta prueba se realiza para detectar la Un resultado positivo para la termonucleasa estara dado por un halo rosado alrededor de produccion de nucleasa termoestable.

hubo crecimiento para determinar el rango de temperatura de crecimiento. Seleccione la temperatura a la cual hubo mayor crecimiento, esta representa la temperatura optima. El desarrollo de crecimiento en este medio y el viraje del indicador de verde a azul, indican que el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como unica fuente de carbono.

SOLUBILIDAD

EN

REACCIONES EN EL AGAR HIERRO-TRIPLE AZUCAR (Agar TSI)

Esta prueba se recomienda para la identificacion de patogenos entericos gram negativos. Se emplea para detectar la fermentacion de lactosa, sacarosa y glucosa, con formacion de acido y gas, y tambien para detectar produccion de acido sulfhidrico.

Taco acido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel acido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada. Taco acido (amarillo): Glucosa fermentada. Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada. Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glucidos es fermentado La aparicion de burbujas en el taco indica que la fermentacion se ha efectuado con produccion de gas. Un ennegrecimiento en el medio indica la produccion de acido sulfhidrico.

DECARBOXILACION AMINOACIDOS (ARGININA, LISINA ORNITINA DECARBOXILASAS)

DE Algunas Y

bacterias poseen unas enzimas +: color purpura turbio a purpura apagado. decarboxilasas especificas que son capaces -: color amarillo claro y brillante. de atacar el grupo carboxilo de determinados aminoacidos, produciendo anhidrido carbonico y una amina, o diamina, con la consiguiente alcalinizacion del medio. Asi: La lisina decarboxilasa (LDC) produce, a partir de la L-lisina, cadaverina. La ornitina decarboxilasa (ODC) produce putrescina. - El aminoacido L-arginina posee un sistema especial de transformacion: primero por accion de una descarboxilasa se transforma en un producto intermedio, la agmatina, la cual, por una Arginina dehidrolasa (ADH) pasa a putrescina y urea. Si el micro- organismo es productor de ureasa transformara a su vez la urea en amoniaco y anhidrido carbonico.