A tcnica da Eletroforese para a anlise de DNA e protenas

Eletroforese
Movimento de partculas dispersas num fludo sob influncia de um campo eltrico uniforme DNA, carga negativa
Tem tendncia a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo eltrico

Serve para separar molculas por tamanho/carga eltrica Tcnica utilizada exausto em trabalhos de biologia molecular

Detergente SDS
Cada molcula de protena se liga a um grande nmero de molculas do detergente dodecil sulfato de sdio (SDS) carregado negativamente, que supera a carga intrnseca da protena e faz com que ela migre em direo ao eletrodo positivo, quando uma tenso aplicada. As protenas do mesmo tamanho tendem a migrar atravs do gel com velocidades similares, pois sua estrutura nativa ser completamente desdobrada pelo SDS, de maneira a que elas se liguem a uma mesma quantidade de SDS tendo, portanto, a mesma quantidade de cargas negativas. As protenas maiores, com mais carga, so submetidas a foras eltricas maiores e tambm a um retardamento maior. Livres em soluo, os dois efeitos seriam anulados, mas nas malhas do gel poliacrilamida, que age como uma peneira molecular, as protenas maiores so retardadas muito mais do que as menores. Como resultado, uma mistura complexa de protenas fracionada em uma srie de diferentes bandas de protenas arranjadas de acordo com sua massa molecular. As protenas majoritrias so facilmente detectadas corando-se as protenas do gel com um corante como o azul Coomassie, e mesmo as protenas menos abundantes so visualizadas em gis tratados com colorao de prata ou ouro (com o qual pequenas quantidades, como 10 ng de protena, podem ser detectadas em uma banda).

Eletroforese, etapas
1.Preparao do gel 2.Aplicao das amostras 3.Eletroforese 4.Colorao 5. Anlise dos resultados

Preparao do gel
Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida

Aplicao das amostras

Definio do mapa das amostras por canaleta

Corrida do gel
Aplicao do campo eltrico Fonte eltrica gera fluxo de ons atravs da soluo tampo Terminais positivo e negativo

Tempo adequado, seno o DNA sai do gel

Colorao das molculas

Brometo de etdio
Agente intercalante do DNA
Cancergeno!

Composto fluorescente luz UV Gel de agarose

Prata
Gel SDS-PAGE
PoliAcrilamide Gel Electrophoresis

Melhor resoluo

Coomassie blue, etc

Eletroforese em campo pulsado

Grandes fragmentos de DNA

PCR a reao em cadeia da polimerase

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
http://dotsub.com/view/538a719f -927b-4192-8e95-18a92a9e95a5

PCR
Sistema de reao: DNA molde (100 ng) Iniciadores (5 mM) dNTPs Tampo com MgCL2 Taq polimerase

Protocolo de amplificao: Desnaturao: 95 C Anelamento: 45-60 C Extenso: 72 C

Primers so pequenos pedaos de DNA produzidos em laboratrio. Por serem feitos dessa maneira, os primers podem conter qualquer sequncia de nucleotdeos que for desejada. Em um PCR experimental, dois primers so feitos para marcarem o seguimento de DNA que se deseja copiar. Atravs do pareamento de bases complementares, um primer liga-se fita superior de DNA no fim do seguimento de interesse e o outro primer liga-se fita inferior no outro fim de segmento. Na maioria dos casos dois primers, que so aproximadamente 20 nucleotdeos, iro marcar apenas um segmento de todo o genoma. Primers tambm so necessrias porque a enzima DNA Polimerase no consegue produzir uma fita de DNA sem a presena de uma fita inicial, ou seja, somente a fita inicial no seria o bastante para que houvesse a fase de extenso. DNA Polimerase uma enzima que tem por funo copiar clulas de DNA antes de sua diviso. Quando uma DNA Polimerase entra em contatado com um primer, esta se alinha ao fim da cadeia do primer e comea a criar uma fita complementar pela adio de nucleotdeos que esto em soluo.

Reao em cadeia

Amplificao do DNA

Etapas da PCR
Ciclos da PCR
Separao das fitas 96C Anelamento dos primers 60C Sntese do DNA 37C

Problema inicial da tcnica

Durante a etapa de quebra das pontes de H e separao das fitas (DNA melting) a 96C, a enzima polimerase era desnaturada e precisava ser acrescentada ciclo a ciclo... No permitia automao