OBTENCIN DE CIDOS NUCLEICOS

OBTENCIN DE ADN
Evitar toda destruccin enzimtica o mecnica. Vulnerables a la digestin por las nucleasas endgenas una vez que La clula es lisada. Obtener la mxima cantidad de la mejor calidad

OBTENCIN DE ADN
ESPECIMEN CONCENTRACIN DE ADN

Fluido amnitico
Sangre (mamferos) Vellosidad corial Races de pelo

65ng/ml
40ug / ml 8 ug / ml 250 ug / ml

Hgado
Msculo Piel

15 ug / ml
3 ug / ml 3 ug / ml

Esperma

3,3 ug / ml

OBTENCIN DE ADN
Homogenizacin de las clulas

Destruccin de ncleos y liberacin del ADN

Eliminacin de protenas

Precipitacin del ADN

Extraccin de ADN
Los cidos nuclecos deben ser solubilizados de las clulas o de otro material biolgico. SDS, el hervir. Estas condiciones que desnaturalizan, solubilizan eficientemente los cidos nucleicos y no los afectan. Adems, las condiciones que desnaturalizan promueven el retiro de protenas durante los pasos subsecuentes. Inhiben la actividad de las nucleasas que degradarn los cidos nuclecos

Extraccin de ADN
Tratamiento enzimtico. Degradar componentes indeseados. Inclusin de proteasas (la proteinasa K) en el lisado se promover el retiro de protenas. La proteinasa K sigue siendo activo a 65 en presencia de SDS. La temperatura elevada y el SDS mejoran solubilidad e inhiben cualquier actividad deDNAsas que pueda estar presente en el lisado. Las nucleasas se pueden tambin utilizar para quitar los cidos nucleicos indeseados. Por ejemplo, muchos protocolos de la extraccin del ADN incluyen un paso de tratamiento del ARNsa, y viceversa.

Extraccin de ADN
Separacin del ADN de material contaminante (protenas) El fenol es un solvente orgnico que se utiliza para separar las protenas de los cidos nuclecos. Las protenas pierden su solubilidad y se precipitan. Las protenas son hidrofbicas y se encuentran en la fase orgnica. Los cidos nuclecos estn altamente cargados y se encuentran en la fase acuosa. Fcil de hacer y se pueden adaptar a muchos usos. Tambin se aplica fcilmente sobre una amplia gama de volmenes . La extraccin del fenol se utiliza extensamente para el aislamiento del ADN geonmico de alto peso molecular.

Extraccin de ADN
La extraccin del fenol es lograda mezclando la muestra con un volumen igual de fenol que se ha saturado previamente con Tris buffer de pH 8 que contenga EDTA y NaCl. El fenol debe ser fenol del grado de la biologa molecular y debe almacenarse a -20C hasta la preparacin de la solucin saturada. La solucin saturada se almacena a 4C. El fenol se oxida fcilmente, se amarillenta, y los productos de la oxidacin pueden romper el ADN. El fenol oxidado debe ser desechado.

Extraccin de ADN
La fase acuosa se retira del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitacin con fenol y centrifugacin hasta que ya no se retire ms protena de la solucin. Los cidos nucleicos se separan de la solucin con la adicin de etanol frio

LISIS CELULAR
Centrifugar

Adicionar 25ul de SDS al 10%, proteinasa K. Mezclar suavemente por inversin 45veces

Disolver el botn celular en buffer de lisis. (NaCl 50mM EDTA 10mM en 50 mM de Tris Cl pH 7.5)

Separar el botn celular (serie blanca).

Incubar a 65C por 1 hora (37 C x toda la noche). Mezclar por inversin cada 15 minutos.

Extraccin con Fenol Cloroformo Alcohol Isoamilico

Fase acuosa (ADN) Protenas Fenol

A la muestra que se le realiz lisis celular, adicionar fenol cloroformo alcohol isoamilico 25:24:1. Mezclar por inversin

Centrifugar

Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Adicionar fenol cloroformo alcohol isoamilico 25:24:1. Mezclar por inversin

Fase acuosa (ADN) Protenas Fenol

Centrifugar Centrifugar

Fase acuosa

Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Adicionar cloroformo alcohol isoamilico 24:1. Mezclar por inversin

Adicionar de fenol cloroformo alcohol isoamilico 25:24:1. Mezclar por inversin

Precipitacin, lavado y almacenamiento del ADN

ETANOL ABSOLUTO

Centrifugar

A la fase acuosa de la ultima extraccin con Cloroformo isoamil 24:1, adicionar alcohol absoluto frio dos veces el volumen de la fase acuosa.

Mezclar muy suavemente primero por inversin y luego por movimientos giratorios. Se observa un precipitado

Descartar el sobrenadante.

ETANOL AL 70%

Adicionar de buffer TE 1X, tapar y permitir disolver a temperatura ambiente (15 minutos). Almacenar a 4C.

Descartar el sobrenadante. Dejar el tubo abierto hasta que se seque el ADN (transparente). 10 minutos aproximadamente

Adicionar de etanol al 70% (fro). Mezclar muy suavemente primero por inversin y luego por movimientos giratorios.

Extraccin de ADN por el mtodo de CTAB

Bromuro de Cetilmetiltrimetilamonio CTAB: es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran magnitud molecular , y tiene propiedades detergentes; se conocen con el nombre de jabones invertidos, debido a que su actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y no a uno negativo, como sucede en los sulfatos de alquilo e hidrgeno, que son los detergentes usuales. En este mtodo se utiliza un buffer que contiene proteinasa K, CTAB, NaCl , EDTA , Tris Cl pH 7.5, dicho buffer permite la destruccin de las membranas nucleares, liberando los cidos nucleicos. La extraccin de los cidos nucleicos se realiza con fenol cloroformo:alcohol isoamlico, para posteriormente ser precipitados con etanol absoluto fro y luego con etanol al 70%.

CUANTIFICACIN DEL ADN

ESPECTOFOTOMETRIA:
Absorcin a 260nm. Protocolo para la Cuantificacin de ADN. Haga una dilucin 1/10 del ADN extrado utilizando el mismo solvente donde lo diluy inicialmente (agua destilada estril o tampn TE 1x) Mida la absorbancia de la dilucin a 260 nm. Aplique las siguientes frmulas. Una densidad ptica 1 es igual a 50 ug/ml de ADN de doble cadena, 40 ug/ml de ADN de simple cadena o ARN y 20 ug/ml de oligonucletidos de simple cadena Para evitar una eventual contaminacin proteica se efecta una segunda medida de absorbancia a 280nm.Un ADN puro debe tener una relacin D260/ D280 comprendida entre 1.8 y 2. Si los valores obtenidos son significativamente menores a 1.8 implica contaminacin con protenas o fenol dependiendo de la tcnica de extraccin que se halla empleado.

CUANTIFICACIN DEL ADN

No es recomendable trabajar con soluciones de ADN muy concentrado, pues estas soluciones son extremadamente viscosas y pueden dar lugar a errores de volumen al pipetear. El ADN tambin se puede determinar con ms sensibilidad y especificidad analtica por fluorometria tras la coloracin con un producto determinado. El mtodo indirecto ms recomendable para la determinacin de la concentracin de ADN en una muestra es mediante la visualizacin de un gel de electroforesis en el cual se colocan muestras con concentraciones conocidas.

OBTENCIN DE ARN
La mayora de los protocolos del aislamiento del ARN tambin implican extracciones del fenol y son similares a los aislamientos del ADN. TRIZOL. Precauciones contra la actividad de la Rnasas deben ser tomadas. Las Rnasas son enzimas extremadamente estables y activas. Utilizacin de Dietilpirocarbonato DEPEC para eliminar RNAsas. Siempre use guantes desechables . Utilice material de plstico estril y libre de Rnasas y pipetas destinadas exclusivamente para RNA. En la presencia del TRIZOL, el RNA queda protegido de la contaminacin con Rnasas. PREPARACION DE AGUA DEPEC: 1ml de DEPC X 1000ml de agua. 37C X 12 horas. Autoclavar (121 C15 lb X 20 minutos).

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS
Los cidos nucleicos son macromolculas polianinicas uniformemente cargadas que pueden migrar en un campo elctrico. La electroforesis a travs de geles de agarosa o poliacrilamida es el mtodo estndar que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Tiendo el gel con una baja concentracin de bromuro de etidio, se puede determinar la localizacin del ADN dentro del gel. El ADN se puede recuperar del gel y usar para una gran variedad de anlisis de clonaje. Los geles de agarosa pueden variar en cuanto a forma, tamao y porosidad. La seleccin de las caractersticas de estos parmetros depende principalmente del tamao de los fragmentos a separar.

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

Las molculas de ADN con un tamao comprendido entre 200pb y 50 kb de longitud se pueden separar en geles de agarosa de diversa concentracin . Electroforesis horizontales en un campo elctrico de direccin constante. Concentracin de agarosa y tamao del ADN.

FACTORES QUE AFECTAN LA MOVILIDAD DEL ADN EN GELES DE AGAROSA

CONCENTRACIN DE AGAROSA Y TAMAO DEL ADN Las molculas de mayor tamao migran ms despacio debido a la dificultad que encuentran al pasar a travs de los poros del gel.
% DE AGAROSA TAMAO DEL ADN (Kb)

0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

5-60 1-20 0,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2

FACTORES QUE AFECTAN LA MOVILIDAD DEL ADN EN GELES DE AGAROSA

VOLTAJE Los fragmentos de ADN migran a travs de la agarosa a una velocidad proporcional al voltaje aplicado. La capacidad de separacin disminuye conforme se aumenta el voltaje. COMPOSICIN DE BASES Y TEMPERATURA No se altera ni por la composicin de bases ni por la temperatura a la que se realiza el corrido. COMPOSICIN DE LA SOLUCIN AMORTIGUADORA En ausencia de iones la conductancia elctrica es mnima y el ADN migra muy despacio. Si la fuerza inica es muy elevada, se genera un exceso de calor y el gel incluso puede llegar a derretirse.

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

Para separar fragmentos pequeos de ADN. (5500pb). Su poder de resolucin es extremadamente alto y permiten separar fragmentos que difieren entre s tan slo en un par de bases. Se usan en una configuracin vertical y a un voltaje constante. Aplicaciones: Purificacin de oligonucleotidos de sintesis Determinacin de secuencias de ADN. Separacin de fragmentos pequeos de ADN

ENZIMAS DE RESTRICCIN

ENZIMAS DE RESTRICCIN
Corta el ADN cuando reconoce una secuencia especfica. Tipo I: Una vez que la secuencia ha sido reconocida , la enzima se desplaza sobre el ADN, se fija de manera aleatoria y a unos 1000 a 5000pb libera algunas decenas de nucletidos. Tipo II: Una vez reconocida la secuencia, la enzima corta en la secuencia de reconocimiento. Tipo III: Estas enzimas reconocen la secuencia, pero cortan una veintena de nucletidos ms lejos.

Eco RI

Escherichia

coli

cepa

nmero de enzima descubierta

Pst I Primera enzima descubierta en Providencia stuarti

Enzimas de Restriccin Tipo II

SECUENCIAS PALINDROMICAS: La secuencia es la misma cuando se lee de derecha a izquierda en una hebra y de izquierda a derecha en la otra hebra.

Formacin de ADN recombinante

HIBRIDACIN

HIBRIDACIN
Dos molculas de cido nucleico de cadena sencilla con secuencia de bases complementaria puede formar un hbrido de doble cadena

HIBRIDACIN
Cuando un ADN bicatenario se calienta a una temperatura superior a la temperatura de fusin (Tm), las dos molculas se separan , debido a la ruptura de los puentes de hidrgeno. No se observa re asociacin entre ellas si la temperatura disminuye rpidamente, quedando el ADN en forma de cadena sencilla con una estructura espacial no ordenada.
Cadena simple

D O a 2 6 0 n m

Doble cadena

Tm

Temperatura

HIBRIDACIN
Si despus de la separacin de las cadenas de ADN se produce un enfriamiento lento y progresivo en unas condiciones de medio favorables se observa una reasociacin progresiva de las cadenas: HIBRIDACIN La reasociacin solamente se produce entre secuencias complementarias, que pueden ser ADN, ARN e incluso hbridos ADN/RNA.

SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS

Sondas de cidos nucleicos son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con enzimas, sustratos antignicos marcaje quimioluminiscente, o radioisotopos y que pueden unirse con alta especificidad a secuencias complementarias de cidos nucleicos. La sonda puede ser dirigida para cualquier blanco ADN ARN. Puede ser de 20 hasta cientos de pb. Las sondas de oligonucleotidos (poseen menos de 50pb), pueden ser sintetizadas qumicamente y purificadas con relativa facilidad utilizando diversos instrumentos comerciales. Las sondas de oligonucleidotidos tienen la ventaja de hibridizar ms rpidamente molculas blanco, y pueden bajo condiciones de astringencia detectar el cambio de un solo nucletido dentro de la secuencia de cidos nucleicos.

SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS

ASTRINGENCIA La astringencia esta relacionada con el nmero de pb desiguales que pueden ser toleradas cuando dos molculas de cidos nucleicos van ha formar una molcula de doble cadena. La astringencia esta afectada por diferentes variables, incluidas la temperatura, la concentracin de sales, y el pH de la reaccin de hibridacin. Altas condiciones de astringencia se logran utilizando bajas concentraciones de sales o altas temperaturas. Disminuye las desigualdades que se puedan formar. Bajas condiciones de astringencia se logran usando altas concentraciones de sales.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

PCR

PCR
Copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de inters representa tan slo una diez millonsima parte.

PCR
La PCR es un mtodo in vitro de sntesis de ADN con el que un segmento particular de ste es especficamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a travs de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubacin en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. As se obtienen en cuestin de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN

1. Ruptura de los puentes de hidrgeno del ADN para desnaturalizarlo, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95C, por un minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. 2. hibridacin de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los denominados primers o iniciadores (ADN sinttico de hebra sencilla), a una temperatura que facilita el apareamiento de las bases nitrogenadas complementarias de ambas clases de ADNs. 50 y 60C. 3.El tercer paso se efecta a 72C, temperatura a la que la polimerasa extiende la longitud de los cebadores, aadiendo los diferentes nucletidos libres en el orden que le va dictando la secuencia de nucletidos de la cadena que acta como molde

Perfil Trmico
Denaturacin 90 -95C Rompe H-H Activa Taq :La actividad de la enzima decrece de manera muy rpida a partir de los 95C (vida media a 92.5C =2h, a 95C = 40 min. y a 97.5C = 5 min.) Empezar con un perodo de desnaturalizacin prolongado (cinco minutos a 94C), para asegurarse que la desnaturalizacin se lleve a cabo a lo largo de toda la molcula del ADN Contenido G-C y longitud fragmento > tiempo

Perfil Trmico
Anillaje 50-65C Melting Temperature Primers estables unin Tiempo especificidad Tiempo eficiencia

Perfil Trmico
Temperatura melting 50% de la cadena forma una doble hlice estable y el otro 50 % est como cadena sencilla Depende Longitud molcula Secuencia nts Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Disociacin dsADN

Perfil Trmico
Elongacin 72C :mxima actividad de la polimerasa , evitar alineamientos inespecficos de los iniciadores.
Limitada por el tiempo Tiempo: depende del tamao de la amplificacin, debiendo estimar 1 min. para alargar 1000 nucletidos.

Eficiencia F. largos

Componentes de una PCR

BUFFER 10X DEOXINUCLEOTIDOS ( dNTPs ) CLORURO DE MAGNESIO INICIADORES ( PRIMERS ) Taq POLIMERASA ADN TEMPLADO AGUA DESTILADA ESTERIL

Componentes de una PCR

BUFFER 10X: Solucin amortiguadora Adyuvantes: aumentan la especificidad y fidelidad de la reaccin Dimetilsulfxido (DMSO): disminuir la estructura secundaria del ADN. Tween 20 o el Tritn X-100, que ayudan a estabilizar la enzima Polietilenglicol (PEG), el glicerol, la formamida, o la seroalbmina bovina.

Componentes de una PCR

Desoxirribonuclesidos trifosfatados (dNTPs) La variacin en su concentracin afecta la especificidad y fidelidad de la reaccin. Concentraciones altas de los mismos hacen disminuir la fidelidad con la que la polimerasa efecta su trabajo, e incluso pueden llegar a inhibir su actividad. Los dNTPs pueden captar iones de magnesio la concentracin de Mg+2 sea 0.5 a 1 mM superior a la concentracin de los dNTPs.

Componentes de una PCR

Cloruro de Magnesio Concentraciones insuficientes de Mg+2 dan lugar a bajo rendimiento En exceso se obtienen amplificaciones inespecficas.

Componentes de una PCR

Iniciadores Su longitud suele estar entre 18 y 30 nucletidos, G+C entre 40-75 Complementaridad del 100% entre las ltimas 5 a 6 pb del extremo 3. Carecer lo ms posible de estructuras secundarias, as como de complementariedad entre s. Ambos iniciadores deben tener una temperatura de fusin o Tm similar y, por ende, un contenido semejante en G+C.

Componentes de una PCR

Iniciadores La distancia que separa los sitios donde se aparean los cebadores dentro del ADN molde determina el tamao del producto de amplificacin. El tamao ideal depende de la aplicacin: los productos largos se amplifican con menor eficiencia, mientras que los productos muy cortos pueden confundirse con dmeros de los iniciadores y limitan mucho la posibilidad de caracterizarlos posteriormente.

POLIMERASAS DE ADN
Una polimerasa de ADN requiere: Una cadena de ADN templado para copiar Una cadena iniciadora en la cual los nucletidos pueden agregarse. La enzima no puede iniciar la formacin de una cadena de ADN, sta slo puede agregar nucletidos en el extremo hidroxilo 3 terminal de una cadena preexistente.

Componentes de una PCR

ADN polimerasa Polimerasas Termoestables

Taq DNA polimerasa Thermus aquaticus

Vent Thermococcus litoralis. 72C, Incorporan100 nucletidos por segundo

Componentes de una PCR

ADN templado La cantidad de ADN molde puede ser de tan slo 1 ng en el caso de material gentico clonado (en virus o plsmidos), o de un mnimo de 20 ng, cuando se utiliza ADN genmico proveniente de clulas eucariotas. En general, no es necesario purificar el molde, porque la reaccin puede tolerar la presencia de impurezas, pero hay que tener mucho cuidado de eliminar, lo ms posible, la presencia de Inhibidores de la polimerasa, sobre todo en las muestras clnicas. Si el material son suspensiones celulares, puede ser suficiente con romper las clulas por calor.

Contaminacin de las Reacciones de PCR

reas de Trabajo Separadas: Extraccin Preparacin de la Reaccin Adicin del ADN Anlisis del producto de la Reaccin

Contaminacin de las Reacciones de PCR

Equipos diferentes por rea Controles negativos para monitorear y revelar contaminantes Prevenir la formacin de aerosoles Testigo positivo Reaccin Inhibidores de PCR

TIPOS DE PCR

Nested PCR

TIPOS DE PCR

Varias parejas de primers Varios productos de amplificacin

Multiplex PCR

TIPOS DE PCR
Molde inicial ARN Transcriptasa reversa cADN Expresin gnica

RT-PCR

Generalidades de la PCR en Tiempo Real

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Aproximacin Terica a la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

N = N0 x 2n N: Nmero de molculas amplificadas N0: Nmero inicial de molculas n: Nmero de ciclos de amplificacin

El fundamento de la PCR en tiempo real es el mismo de la PCR convencional

Amplificacin por ciclo El nmero de fragmentos blanco es amplificado exponencialmente en cada ciclo
1. ciclos = 2 amplicones

No. de ciclos 1 2 3 4 5 6 20 30

2. ciclos = 4 amplicones

3. ciclos = 8 amplicones

4. ciclos = 16 amplicones

5. ciclos = 32 amplicones

No. De amplicones blanco 2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824

6. ciclos = 64 amplicones

7. ciclos = 128 amplicones

Amplicn: fragmento de ADN especfico que se quiere amplificar

Monitoreando una reaccin de PCR

PCR convencional: El producto de la reaccin slo puede ser evidenciado en geles de agarosa con BrEt aproximadamente en el ciclo 25 de la reaccin. Entre ms ciclos de amplificacin, mayor nmero de copias y ms evidente la banda en el gel de agarosa. Sin embargo, es necesario tener en cuenta el efecto Plateu de la PCR.

PCR en tiempo real: Por medio de un software usted puede evidenciar lo que est ocurriendo en cada ciclo en tiempo real y ver cmo est aumentando el nmero de amplicones en cada uno de stos. Cada uno de los colores representa una muestra diferente.

Aplicaciones de la PCR en tiempo real

Deteccin cualitativa y cuantitativa Deteccin de mutaciones Identificacin de los productos de la reaccin

Campos de aplicacin de la PCR en tiempo real (1)

Deteccin de genes Deteccin especfica del ADN/ARN (ej. Investigacin en oncologa) Identificacin de especies especficas (ej. bacteria, virus) Deteccin de patgenos (ej. legionella, anthrax) Rastreo de resistencia a antibiticos (ej. MRSA, VRE) Monitoreo de la calidad de aguas Expresin de genes Estudios de enfermedad mnima residual (MRD) Determinacin del nivel de expresin del mARN (ej. citoquinas, quimioquinas) Cuantificacin de dosis gnica (ej. Aberraciones cromosomales)

Campos de aplicacin para la PCR en tiempo real (2)

Genotipificacin Mutaciones para la deteccin de cncer Farmocogentica Fingerprint gentico Estudios evolutivos Anlisis de calidad de alimentos Deteccin de organismos genticamente modificados (GMO) Patgenos en comida (ej. Salmonella, E.. coli) Knockdown de genes

Zea mays

Tecnologa LightCycler 1.5 y 2.0

La combinacin de un ambiente de aire para subir y bajar la temperatura en la cmara de reaccin y el uso de capilares optimizan la razn volumen/superficie permitiendo que un ciclo de PCR se realice en 30 segundos y que una corrida completa de PCR de 35 ciclos con 32 capilares se realice en 30 minutos.

La amplificacin del producto del PCR es monitoreado simultneamente en tiempo real y online con diferentes fluorocromos.

Material Asociado a la tecnologa LightCycler 1.5 y 2.0

Capilares LightCycler 100 l y 20 l

Adaptadores para la centrifuga LightCycler en un bloque de enfriamiento Herramienta para tapar los capilares del LightCycler

Carruseles para los capilares de 100 l and 20 l LightCycler

Material Asociado a la tecnologa LightCycler 1.5 y 2.0

Capilares

Los capilares estn hechos de borosilicato, el cual se caracteriza por su buenas cualidades pticas.

Material Asociado a la tecnologa LightCycler 1.5 y 2.0

Bloque de enfriamiento
El bloque blanco que se observa en la figura se debe mantener a -20C y es usado para montar la reaccin de PCR. Este permite que los reactivos y la mezcla maestra se mantengan en un ambiente ptimo mientras se est montando la reaccin.

Material Asociado a la tecnologa LightCycler 1.5 y 2.0 Adaptadores de centrfuga

Los capilares se acomodan perfectamente en los adaptores de metal. Estos adaptadores permiten que los capilares se puedan centrifugar en en microcentrfugas convencionales.

Centrifugar los capilares es necesario para que la mezcla de reaccin quede en el fondo de ste, posteriormente se llevan los capilares al termociclador. Lo que se observa en la figura con forma de esfero es la herramienta que ayuda a tapar los capilares.

Material Asociado a la tecnologa LightCycler 1.5 y 2.0

Una vez los capilares tienen la mezcla de reaccin y estn correctamente tapados se ponen en el carrusel, posteriormente se llevan al termociclador.

Para capilares de 100 l and 20 l

Formatos de deteccin del LightCycler

Todos los sistemas de PCR en tiempo real detectan un fluorocromo y despus relacionan la seal fluorescente con la cantidad de producto de la PCR en una reaccin. Existen diferentes mtodos para detectar y evaluar el producto de la PCR, los ms comunes se encuentra en dos categoras: 1. deteccin independiente a la secuencia 2. deteccin con sondas que se unen de forma especfica a una secuencia

Formatos de deteccin en el LightCycler

SYBR Green I Sondas SimpleProbe Sondas HybProbe Sondas de hidrlisis

Formatos de deteccin en el LightCycler

SYBR Green I
Aproximacin simple y a un precio asequible a la qPCR ste se une al ADN de doble cadena. El SYBR Green I flurece muy poco cuando est libre en solucin pero su emisin aumenta cuando se une al ADN (debido a cambio conformacionales en la molcula del SYBR Green I).

Por lo tanto el aumento en la seal del SYBR Green I (medida a 530 nm) est relacionada con la cantidad de producto amplificado durante la PCR.

Formatos de deteccin en el LightCycler SYBR Green I

Este formato de deteccin puede ser aplicado en ensayos de PCR convencional establecidos pues no requiere oligonucletidos adicionales marcados fluorescentemente. Sin embargo, debido a que este formato detecta tanto productos especficos como no especficos debe ser optimizado y el producto debe ser identificado despus de cada corrida de PCR.

Formatos de deteccin en el LightCycler

SYBR Green I
Cuando el SYBR Green I se une al dsDNA su fluorescencia aumenta unas 100 veces. Durante los diferentes pasos de la PCR, la intesidad de la fluorescencia vara, dependiendo de la cantidad de dsDNA que est presente. Denaturacin: no se une al ADN y la intensidad de la fluorescencia es baja. Anillamiento: los primers se unen a la secuencia blanco, creando pequeas regiones de dsDNA a las cuales el SYBR Green I se puede unir, lo que lleva a un leve aumento de la fluorescencia.

Enlongacin: de la PCR la cadena se extiende y una mayor cantidad de SYBR Green I se puede unir. Al final de la enlongacin todo el ADN es de doble cadena y la mxima cantidad de molculas de SYBR Green I estn unidas -mayor intensidad en la seal.

Formatos de deteccin en el LightCycler

SYBR Green I

Formatos de deteccin en el LightCycler

SYBR Green I Limitaciones

No discrimina entre cadenas de ADN diferentes: Producto especfico No especfico Dmeros de primers *Puede sobre-estimar la concentracin de la secuencia blanco. Curva de fusin se puede discriminar entre el producto y otros artefactos y sta siempre se debe incluir en el programa de SYBR Green I. Para la cuantificacin el PCR se debe optimizar y debe estar libre de artefactos.

Deteccin con sondas que se unen especficamente usando FRET

FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Transferencia de energa de una molcula fluorescente (fluorescena) a otra molcula fluorescente adyacente (ej. LightCycler Red 640). LED azul del instrumento excita la fluorescena (a 470 nm) se genera la transferencia de energa y por lo tanto la excitacin de la molcula LightCycler Red 640 (la cual no se ve afectada directamente por el LED azul). La luz emitida por la LightCycler Red 640 es media a 640 nm.

Deteccin con sondas que se unen especficamente usando FRET

Deteccin con sondas que se unen especficamente usando FRET

Puede ser usado en varias formas para generar una seal secuencia especfica durante la PCR. 1. Suprimir la fluorescencia del donante (ej. Sondas de hidrlisis) fluorocromo

2. Usan la emisin de fluorescencia de una fluorocromo aceptor (Sondas de hibridacin).

Formatos de deteccin en el LightCycler HybProbe o sondas de hibridacion

Una sonda (donante) es marcada en el extremo 3 con fluorescena La segunda sonda (aceptora) est marcada en el extremo 5 con un fluorocromo, por ejemplo LightCycler red (la sonda aceptora se encuentra fosforilada en el extremo 3 para evitar que funcione como primer).

Formatos de deteccin en el LightCycler

HybProbe o sondas de hibridacion Las sondas de hibridacin usan dos oligonucletidos diseados especficamente los cuales hibridan cerca uno del otro, en una secuencia interna del fragmento amplificado durante la fase de anillamiento de la PCR.
Los fluorocromos slo estn cerca cuando los dos oligonucletidos anillan en las regiones blanco adyacentes - transferencia de energa por resonancia fluorescente (FRET).

Formatos de deteccin en el LightCycler

HybProbe o sondas de hibridacion

La energa del fluorocromo de la primera sonda excita el fluorocromo de la segunda sonda, el cual despus emite una energa fluorescente a una longitud de onda diferente. El instrumento detecta la luz emitida por este ltimo fluorocromo.

Formatos de deteccin en el LightCycler

HybProbe o sondas de hibridacion

La energa transferida del donante al aceptor depende en gran parte del espacio entre los dos fluorocromos.

La energa slo es transferida eficientemente si las molculas estn cercanas entre s (entre 1 5 nucletidos).
La cantidad de fluorescencia emitida es directamente proporcional a la cantidad de ADN blanco generado durante la PCR.

Formatos de deteccin en el LightCycler

HybProbe o sondas de hibridacion

Formatos de deteccin en el LightCycler Deteccin Mltiple con HybProbe

Es posible realizar ensayos de deteccin mltiple en una sola mezcla de reaccin usando diferentes flurocromos aceptores en las sondas. En eses caso LightCycler Red 610, LightCycler Red 705 y LightCycler Red 670.

Formatos de deteccin en el LightCycler

Sondas de Hidrlisis
Las sondas de hidrlisis emiten fluorescencia cuando la Taq Polimerasa con actividad exonucleasa 5 3 las hidroliza. En estos ensayos se usa una nica sonda que tiene tanto el reportero fluorescente como el quencher (supresor), los cuales se encuentran cerca uno del otro.

Formatos de deteccin en el LightCycler

Sondas de Hidrlisis
Cuando la sonda est intacta, el quencher est lo suficientemente cerca al reportero para suprimir la seal de fluorescencia del reportero (supresin de la fluorescencia va FRET). Durante la PCR, la actividad 5 nucleasa de la polimerasa cliva la sonda, separando el reportero del quencher y permitiendo que el fluorocromo reportero emita fluorescencia.

Formatos de deteccin en el LightCycler

Sondas de Hidrlisis

La calidad de la sonda de hidrlisis o sonda Taqman depende de:

La supresin de la sonda intacta La eficiencia de hibridacin La actividad de clivaje de la enzima

Formatos de deteccin en el LightCycler

Sondas de Hidrlisis. (ej. Sondas Taqman)