Principi di cromatografia La cromatografia una tecnica di migrazione differenziata che permette la separazione e il recupero dei costituenti di una miscela

a di sostanze affini. La cromatografia pu essere di tipo ANALITICO O PREPARATIVO

Principi di cromatografia
In ogni tecnica cromatografica devono essere identificabili due fasi immiscibili tra di loro : Una FASE STAZIONARIA solida o liquida
Una FASE MOBILE liquida o gassosa La separazione delle molecole dipende dalle interazioni delle molecole stesse con la fase stazionaria e con la fase mobile.

Principi di cromatografia
Fondamento di tutte le tecniche di cromatografia il COEFFICIENTE di RIPARTIZIONE o di DISTRIBUZIONE

Kd
Che descrive il modo con cui un composto si distribuisce tra due fasi immiscibili.

Principi di cromatografia
In ogni istante del processo cromatografico ,le sostanze tendono a distribuirsi tra le due fasi in modo specifico . Supponiamo che le condizioni sperimentali permettano il raggiungimento di equilibri dinamici successivi del tipo :

CM
DOVE

CS

CM = concentrazione di una sostanza nella fase mobile CS = concentrazione di una sostanza nella fase stazionaria

Principi di cromatografia A questi equilibri dinamici corrisponde una costante di equilibrio o coefficiente di distribuzione (Kc) :

Kc = CS / CM
Che dipende solo dalla natura della fase mobile e della fase stazionaria , oltre che dalla temperatura di lavoro, e quindi una grandezza termodinamica.

FASE MOBILE
KCA > KCB

A+B

FASE STAZIONARIA

FASE MOBILE

Durante leluizione le sostanze tendono a separarsi perch A ,pi affine alla fase stazionaria, viene trattenuta pi a lungo.

FASE STAZIONARIA

FASE MOBILE

A e B sono separate e danno due bande distinte.

FASE STAZIONARIA

FASE MOBILE

B raggiunge il limite della fase stazionaria, la parte del componente B disciolta nelleluente esce dal sistema cromatografico , mentre la parte del componente B nella fase stazionaria si trasferisce rapidamente in quella mobile

FASE STAZIONARIA

Principi di cromatografia
MECCANISMO PRINCIPALE DI SEPARAZIONE MECCANISMI SECONDARI Le diverse tecniche cromatografiche vengono classificate sulla base del meccanismo principale di separazione.

CLASSIFICAZIONE in base al meccanismo principale

Liquido solido o di adsorbimento

Liquido-liquido o di ripartizione Scambio ionico

Esclusione
Affinit

Principi di cromatografia Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) non sono perfettamente note. I meccanismi che agiscono sono molti e di natura molto diversa

Principi di cromatografia
INTERAZIONI DEBOLI - LEGAMI IDROGENO - INTERAZIONI DIPOLO-DIPOLO - LEGAMI DI VAN DER WAALS COMPOSTI DI COORDINAZIONE INTERAZIONI STERICHE MECCANISMI DI SCAMBIO IONICO

LIQUIDO-SOLIDO (LSC) O DI ADSORBIMENTO La fase stazionaria un materiale solido costituito da particelle. Sulla superficie dei granuli si trovano dei siti attivi che possono stabilire legami deboli (legami idrogeno, dipolo-dipolo, forze di van der Waals etc.) con le molecole della miscela da separare. Durante leluizione le molecole di ciascuna sostanza si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi, mobile e stazionaria, in misura variabile secondo lentit delladsorbimento.

Meccanismo di adsorbimento
L adsorbimento di una specie S ,proveniente dalla fase mobile sposter dalla superficie della fase stazionaria un certo numero n di molecole del solvente M (la fase fissa risulta sempre ricoperta da molecole di solvente : la superficie della fase stazionaria, in assenza di soluto, si solvata). Aggiungendo un solvente che venga adsorbito pi fortemente del precedente , il soluto fissato sulla fase stazionaria si stacca e passa nel nuovo solvente. Scendendo lungo la colonna, raggiunta la zona libera della fase fissa , il soluto viene nuovamente adsorbito.

Fase mobile (liquido o gas)

Siti attivi

Meccanismo di adsorbimento. La fase stazionaria un solido,in genere un composto inorganico o un polimero organico, con dei siti attivi superficiali che possono interagire con alcuni gruppi funzionali delle molecole da separare.

Fase stazionaria (solido)

LIQUIDO-LIQUIDO (LLC) O DI RIPARTIZIONE

La fase stazionaria un liquido, immiscibile con la fase mobile, che impregna un supporto solido inerte. Durante leluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilit di ciascuna di esse.

Fase mobile (liquido o gas)

La fase stazionaria un liquido che ricopre un supporto solido. Ogni componente della miscela si solubilizza nelle due fasi, mobile e stazionaria, e si ripartisce secondo la solubilit in ciascuna di esse.

Fase stazionaria (liquido)

Supporto (solido)

SCAMBIO IONICO (IEC) La fase stazionaria costituita da una resina a scambio ionico, ossia un supporto organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili (-SO3-,-COO- ,ecc.).

I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere scambiati con gli ioni (dello stesso segno dei controioni) presenti nella fase mobile.

SCAMBIO IONICO
Fase mobile

+ +
Fase stazionaria

controione

Sito attivo

SCAMBIO IONICO
Fase mobile

controione

+
Fase stazionaria

sito attivo

SCAMBIO IONICO
Fase mobile

+ +
Fase stazionaria

controione

Sito attivo

ESCLUSIONE (SEC)
La fase stazionaria un solido poroso o un gel con pori Il meccanismo di separazione determinato esclusivamente dalle dimensioni dei soluti. Le molecole dellanalita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori del gel mentre le molecole troppo grandi vengono escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi molto brevi.

AFFINITA
Mediante una reazione reversibile ,le molecole da separare si legano a gruppi funzionali specifici della fase stazionaria. Con lEluizione si rompono i legami con la fase stazionaria e si recuperano le molecole. La cromatografia di affinit pu essere considerata una variante della cromatografia di adsorbimento.

Cromatogramma
Tutte le separazione cromatografiche (eccetto la separazione su strato sottile nella versione pi semplice) si concludono con la registrazione di un
CROMATOGRAMMA

Il tracciato che descrive landamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo a partire dallistante in cui la miscela viene introdotta nella colonna (t = 0)

Cromatogramma Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita detto picco cromatografico. In condizioni ideali il picco ha la forma simmetrica di una curva gaussiana, perch dovuto allinevitabile processo di dispersione zonale che ogni sostanza subisce mentre scorre nella colonna. Matematicamente una curva gaussiana viene descritta dal punto di massimo e nella distanza tra i punti di flesso che divisa per 2 non altri che la deviazione standard .

Cromatogramma

Cromatogramma

Larea totale sottesa alla curva del picco proporzionale alla concentrazione di sostanza separata e ,di conseguenza, viene utilizzata come parametro di riferimento nellanalisi quantitativa.

CROMATOGRAFIA LETTURA DEL CROMATOGRAMMA

tM

t
picco della FASE MOBILE picco dell ANALITA

Il tempo impiegato dalla fase mobile (specie non ritenuta) a fuoriuscire dalla colonna detto tempo morto (tM), ed esprime il tempo impiegato dal fronte di fase a percorrere lintera circuitazione che collega reservoir che lo

contiene al sistema di rivelamento

CROMATOGRAFIA LETTURA DEL CROMATOGRAMMA

tR

tMo

t
picco della FASE MOBILE picco dell ANALITA

Il tempo impiegato dal soluto per eluire dalla colonna detto tempo di ritenzione (tR), e rappresenta il tempo impiegato dallanalita a raggiungere il rivelatore, misurato dal momento in cui la miscela viene introdotta nel flusso di fase mobile

fino allistante in cui si registra il massimo del tracciato cromatografico.

CROMATOGRAFIA LETTURA DEL CROMATOGRAMMA

tR

tR tMo

t
picco della FASE MOBILE picco dell ANALITA

Il tempo di ritenzione corretto (tR) corrisponde al tempo speso dallanalita per attraversare il letto cromatografico, e corrisponde alla differenza

tR = tR - tM

Cromatogramma
Il tempo di ritenzione di una sostanza che praticamente non viene trattenuta dalla fase stazionaria detto TEMPO MORTO (tm). Qualsiasi sostanza, per giungere al rivelatore, deve trascorrere nella colonna un tempo almeno uguale al tempo morto.

Cromatogramma

In alternativa al tempo di ritenzione (tR) si pu misurare il volume di ritenzione VR, entrambi sono parametri importanti per lanalisi qualitativa dando indicazioni del grado di affinit della sostanza eluita nei confronti della fase stazionaria.

Cromatogramma

Analogamente parliamo di VM (detto anche volume interstiziale o volume della fase mobile) e che non altri che il volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria, e quindi a disposizione della fase mobile. Possiamo definire il volume di ritenzione corretto come: VR = VR - VM

Cromatogramma
La relazione tra il tempo di ritenzione e il volume di ritenzione la seguente:

VR = tRFc
dove : VR = volume di ritenzione TR = TEMPI DI RITENZIONE FC = flusso della fase mobile (mantenuto costante durante tutta la

separazione cromatografica).

Relazione analoga tra i parametri corretti : VR = tRFC