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Prctica #1: Determinacin de Protenas Sricas Totales por el mtodo de Biuret

FECHA DE REALIZACION: 03 DE SEPTIEMBRE DE 2008 FECHA DE ENTREGA: 01 DE OCTUBRE DE 2008

Objetivos
Los alumnos deben conocer la importancia de la utilizacin del mtodo de Biuret as como su eficiencia para la determinacin de protenas sricas totales, y su fundamento a nivel molecular.

1. Importancia de las Protenas


Las protenas son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. El nombre protena proviene de la palabra griega ("prota"), que significa "lo primero" o del dios Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar. Las protenas desempean un papel fundamental en los seres vivos y son las biomolculas ms verstiles y ms diversas. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan la enzimtica, hormonal, transportadora (hemoglobina), defensiva (anticuerpos), estructural (colgeno), etc. Las protenas de todo ser vivo estn determinadas genticamente, es decir, la informacin gentica (genes) determinan qu protenas tendr un individuo.

2. Tipos y Funcin de las Protenas

Segn su contenido en aminocidos esenciales. Segn su estructura qumica. FUNCIONES - Plstica, estructural o de construccin. - Reguladora. - Defensiva. - Intervienen en procesos de coagulacin - Transporte de sustancias. - Energtica

IMPORTANCIA DE LAS PROTENAS PLASMTICAS


Suponen el 8% de los elementos que estn disueltos en el plasma. Forman parte de las protenas hemticas. Son muy accesibles para el laboratorio. Estn relacionadas con los tejidos y clulas del organismo.

PROPIEDADES Y FUNCIONES
Transporte. Equilibrio osmtico. Defensa de las infecciones. Hemostasia. Contribuyen a las necesidades de nitrgeno. Regulan la funcin celular

Mtodos para la medicin de protenas plasmticas


Por electroforesis. Se separan cinco fracciones: Albmina Alfa 1 globulinas Alfa 2 globulinas Beta globulinas Gamma globulinas

Albuminas
a) Producidas por el hgado.

b) Es la ms abundante. c) Esta firmemente regulada. d) Ejerce alrededor del 75% de la presin coloidoosmtica. e) Ejerce funcin de transporte de sustancias.

Globulinas
a) Se separan electroforticamente en a , b y c. b) Las a y b son sintetizadas en su mayora en el hgado. c) En el grupo a y b estn la mayora de las protenas de fase aguda. d) Las c globulinas son, en su mayora, inmunoglobulinas secretadas por las clulas plasmticas.

GLOBULINAS ALFA 1 Y ALFA 2


Globulinas alfa 1: Son glucoprotenas, lipoprotenas y otros tipos proteicos. Globulinas alfa 2: Son glucoprotenas como, por ejemplo, la eritropoyetina.

Medicin de Protenas Plasmticas


a. Mtodo de Biuret Especfico. Mide concentraciones entre 1 y 10 g/dl. b. Mtodo de precipitacin y unin a protenas Sirven para concentraciones menores a 1 g/dl. c. Mtodo de Refractometra Fsico (ndice de refraccin de la luz) Necesita que el fluido sea transparente.

4. Valores normales de protenas sricas en nios, hombres y mujeres


ADULTOS DE 6 8.3 g/dl. NIOS DE 6.2 - 8.0 g/dl. RECIEN NACIDOS 4.6 7.3 g/dl. El rango normal es de 3.4 a 5.4 g/dl.

5. Composicin del reactivo de Biuret


El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

6. Reaccin Qumica de Biuret


Esta reaccin es propia de la unin peptdica y lleva este nombre por que es positiva para el biuret que presenta una unin peptidica, pero que no es un dipptido puesto que no resulta de la combinacin de dos molculas de aminocidos con eliminacin de una molcula de agua. O=C(NH2)2 + O=C(NH2)2 ----> O=C(NH2)-NH-C(NH2)=O + NH3. La reaccin es sencilla se agrega solucin de NaOH al 10% a la muestra, luego se calienta y despus se agregan 3 o 4 gotas de solucin de Sulfato de Cobre al 1%. La presencia del grupo -C=O(NH-) produce un color purpura violaceo.

Artculos
Papel de nuevas protenas mitocondriales en el balance energtico, por A. Zorzano., et. al., Universidad de Barcelona.
El metabolismo celular genera calor, a parte de los periodos de la reproduccin o de la lactancia, una considerable proporcin de la energa que un individuo adulto en reposo obtiene de la ingesta alimentaria se pierde en forma de calor liberado durante el metabolismo celular. La activa produccin de calor en el tejido adiposo se explica mediante la elevada expresin de la protena desacopladora UCP-1. Se ha propuesto que esta protena acta como un transportador de protones desde el espacio intermembrana mitocondrial hacia la matriz mitocondrial, provocando la perdida del gradiente mitocondrial de protones y en consecuencia aumentando la respiracin desacoplada y la generacin de calor.

De todas las observaciones se puede destacar dos conceptos bsicos:


a.- en algunos tejidos como el musculo esqueltico, las mitocondrias estn organizadas formando intricadas redes mitocondriales, y estas redes trabajan como unidades elctricas para transmitir el potencial de membrana mitocondrial. b.- Se requiere una funcin mitocondrial normal para la correcta homeostasis de sustratos oxidativos, ya que una disfuncin mitocondrial puede conducir a enfermedades metablicas o contribuir a la fisiopatologa de la obesidad y de la diabetes.

Metodologa
Extraer 5 ml de sangre utilizando heparina como anticoagulante Cada equipo debe preparar 10ml de estndar de protena disolviendo 0.2g de albumina en 5 ml de hidrxido de potasio 0.3 N y aforando a 10 ml con agua destilada Cada equipo preparara 10ml de hidrxido de potasio 0.3 N En un tubo de ensaye agregar 0.1 ml de suero, 0.9 ml de agua destilada, 4.0 ml de reactivo de Biuret. Por duplicado Utilizamos un blanco, al cual le agregamos 1 ml de agua destilada, 4.0 ml de reactivo de Biuret Incubar a 37C durante 30 min. Leer a 540 nm en el espectrofotmetro Trazar una curva estndar, tomando en cuenta la concentracin en protena es: 0.002, 0.004, 0.006, 0.008, 0.010, 0.014, para los tubos 1, 2, 3, 4, 5,6.

Resultados
Solucin estndar de protena
1 2 0.1 0.2 Agua Destilada

Reactivo de Biuret
4.0 4.0

Promedio

0.9 0.8

0.037 0.073

0.038 0.073

0.0375 0.073

3
4 5 6

0.3
0.4 0.5 0.7

0.7
0.6 0.5 0.3

4.0
4.0 4.0 4.0

0.109
0.119 0.159 0.247

0.109
0.119 0.159 0.247

0.109
0.119 0.159 0.247

Muestras problema
Blanco 0 Muestra Problema 1 0.350 Muestra Problema 2 0.578

r = 0.9996

ABSORBANCIA

CONCENTRACION

Anlisis de Resultados
DATOS OBTENIDOS DE LA LINEALIDAD DEL METODO LLEVANDO A CABO LA SIGUIENTE ECUACION: CUANDO Y VALE 0.347 X = 0.020 Y ASI PARA CADA UNO DE LOS DATOS OBTENIDOS PARA LA LINEALIDAD DEL METODO. OBTENIENDO UNA= r = 0.9996 AL INTERPOLAR LA MUESTRA PRBLEMA EN NUESTRO GRAFICO OBTENEMOS UNA CONCENTRACION = 0.208 Llevando a cabo los clculos para obtener la concentracin final de albumina srica obtenemos. (Concentracin en g / ml de suero) x 100 = (0.208 g / 0.1ml) x 100 = 0.0208 g/ml por lo tanto obtenemos 0.2 g/dl

Conclusiones
Como podemos observar en los resultados obtenidos en la determinacin de protenas en especifico albumina, se llevo a cabo la realizacin de la curva estndar pero est en las concentraciones inciales se obtena una curva con un r= 0.9699, por lo cual se procedi a realizar la linealidad del mtodo obteniendo as una curva ms prolongada en la que se pudo interpolar el resultado obtenido en el espectrofotmetro, y de esta forma determinar la concentracin de protenas (albumina) en suero, al comparar la concentracin de albumina podemos observar que esta sale de los valores normales ya que estos oscilan entre los 3.5 y 6.5 g/dl, y nosotros obtuvimos 2.0 g/dl, pero tomando en cuenta los valores normales de las globulinas alfa observamos que estn dentro de los valores normales de 0.2 a 0.4 g/dl.

Clnicamente podemos mencionar que la disminucin de las protenas totales, se puede deber a una mala alimentacin, un sndrome nefrtico, una enteropata, tambin se puede mencionar que algunas veces la mala prctica nos puede dar una baja de protenas debido a una hemolisis en los tubos o en la toma de muestra, por lo cual recomendaramos al paciente, realizarse una segunda prueba para corroborar si existe una disminucin de protenas o es un resultado falso positivo y un mal manejo por parte del qumico, as mismo se recomienda que esta prueba se haga en ayunas para una mejor determinacin y no exista interferencia por parte de algunos alimentos que se encuentren ingresando a un proceso metablico.

Bibliografa
http://www.uv.es/jcastell/Proteinas_plasmaticas.pdf http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/108 9/1/Proteinas-sericas-en-enfermedadeshematologicas.html

BIBLIOGRAFIA
Boyer, R: Conceptos de Bioqumica, Internacional Thomson Editores, S. A., Mxico, D. F., 1.999. Herrera, E., Bioqumica, McGraw-Hill Interamericana, 2da edicin, Vol. I y II, Madrid, Espaa, Horton, H.R., Moran, L. A., Ochs, R. S., Rawn, J. D., Scrimgeour, K. G.: Bioqumica, Prentice - Hall Hispanoamericana, S. A., Mxico, 1ra edicin, 1.995. A. Zorzano, D.Bach et.al. Papel de nuevas proteinas mitocondriales en el balance energtico . Rev. Med. Univ. Navarra. 2004; 48:2 3035
http://www.uv.es/jcastell/Proteinas_plasmaticas.pdf http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/1089/1/Proteinassericas-en-enfermedades-hematologicas.html http://www.uv.es/jcastell/Proteinas_plasmaticas.pdf http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/1089/1/Proteinassericas-en-enfermedades-hematologicas.html

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