Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para Leishmania sp.

Blga. Mercedes Maritza Quispe Flrez

Anlisis por PCR

Inventor :
En el ao 1983 el Dr. Kary Mullis invent el procedimiento y 10 aos mas tarde recibi el premio Nbel de Qumica y una gratificacin de US$ 20.000.

Anlisis por PCR

Tcnica invitro que permite la sintesis enzimtica de secuencias especficas de DNA, utilizando cebadores oligonucleotidos que hibridan las cadenas opuestas en la regin de inters en el DNA blanco

Consta de tres etapas: 1. Etapa: Desnaturalizacin 94C 2. Etapa: Hibridacin 50 60C Importante: Calcular la Tm de los cebadores Tm = 4(G+C) + 2(A+T) 3. Etapa: Polimerizacin 72C Temperatura ptima de la enzima Taq polimerasa.

Componentes de la PCR

DNA molde DNA polimerasa termoestable Cebadores: Oligonucletidos Desoxirribonucletidos trifosfato (dATP,dTTP,dCTP,dGTP) Magnesio Termociclador

1 LISIS CELULAR
PROTEINASA K Incubacion 60/2hr.

2 EXTRACCION CON DISOLVENTES ORGANICOS

Fase Acuosa - ADN

Fenol: Cloroformo

Separacn fases

Fase orgnica -Proteinasa -Lipidos

3 PRECIPITACION ADN

Etanol

Centrifugacion

DNA POLIMERASAS

Direccin de polimerizacin 5-3. Necesita 3-OH. Copian molde. Usan dNTP Taq Thermus aquaticus Vent Thermococcus litoralis Pfu Pyrococcus furiosus Tth Thermus thermophilus

Oligonucletidos
Secuencia que flanquea el fragmento a amplificar Tamao de 10 -24 nucletidos Diseo: 3-OH bien apareado

Oligonucletidos para deteccin de Leishmania sp.

MP1-L 5 TACTCCCCGACATGCCTCTG3 MP-3H 5 GAACGGGGTTTCTGTATGC 3 Especficos para el complejo Leishmania braziliensis Producto de amplificacin de aproximadamente 100 pb (revalo, 1991; Llanos, 1999; Alvarez, 2001)

Concentracin de MgCl2

Afecta a la actividad de la polimerasa Incorporacin de dNTP Temperatura Tm Cebador molde

A = 0.5 Mm B = 0.8 mM

C = 1.5 mM D = 2 mM

E = 2.5 mM F = 3 mM

Protocolo bsico de PCR

Preparacin de Master Mix para PCR de Leishmania sp.

Componentes DNTPs (200uM) Buffer 10X P (MP-1L) (100pmol) P (MP-3H (100pmol) DNA Agua Taqpol 5 U/ul) Volumen Final Master 1 X 2.5 2.5 1.5 1.5 5 12 0.05 25ul Master 20X

Condiciones de PCR
Denaturacion inicial (HOT STAR) 94 C por 3 min Ciclo de amplificacion para un total de 30 ciclos Denaturacion 94 C por 1 min Hibridizacion 55 C por 1 min 30 seg Elongacion 72 C por 1 min Elongacion final 72 C por 5 min Tiempo total estimado 2h y 50 minutos

Control de contaminacin

Siempre se deben utilizar blancos de reaccin Utilizar reactivos grado BM puesto que no introducen nucleasas, metales pesados y otros posibles contaminantes inespecficos Adicin controlada de agentes antimicrobianos (0.025% azida de sodio) Pipetas solo para PCR y puntas con filtro (efecto aerosol) Soluciones concentradas de trabajo: 10XPCR, 50 mM MgCl2, 20 mM dNTPs