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Universidad de la Amazonia Programa de Biologa Molecular

Por: Jhorman M. Forero Biologa VII Prof. Girley Collazos .

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INTRODUCCIN
La familia Tephritidae contiene alrededor de 450 gneros y 4300 especies descritas a nivel mundial, hacindola una de las ms grandes del orden Diptera (Paul et al., 2002). Las larvas en particular causan los mayores daos directos al barrenar los frutos, e indirectos al limitar la comercializacin de los mismos Selivon y Perondini (1998) mencionan que la morfologa de las larvas de esta familia es muy similar entre si, dificultando la identificacin de las distintas especies, ya que las principales diferencias morfolgicas se observan en el ltimo instar. Los marcadores genticos en la ltima dcada han favorecido un avance espectacular en la taxonoma molecular y en la diferenciacin de especies e infraespecies (Reyes et al, 1996; Han and McPheron, 2001).

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MATERIALES Y MTODOS
Larvas vivas de tercer instar de las tres especies de Anastrepha: A. ludens, A. oblicua y A. striata fueron obtenidas de los laboratorios de cra del Programa MOSCAFRUT y grupo de referencia a Drosophila melanogaster.
Larvas Lavaron Y desinfectaron Alcohol 70% Maceraron Nitrog. Liq. El DNA se extrajo con el protocolo de Sambrook et al. (1989)

DNA se diluy en 50 L de agua bidestilada Gel de agarosa 0.8%

Doble fenolizacin.

Adicin de una mayor cantidad de RNasa (10,000 g/mL)

Con

Amortiguador TAE 1X

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MATERIALES Y MTODOS PCR- RAPDs


La tipificacin de los genomas de las 4 especies de moscas de la fruta
Serie C (Carl Roth GMBH, Co.)
OPC-01 OPC-02 OPC-09 OPC-13 Seleccionando 14 iniciadores La tcnica de RAPDs

OPC-03

OPC-04

OPC-05

OPC-06

OPC-08

OPC-10

OPC-11

OPC-12

OPC-14 OPC-15

OPC-16

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MATERIALES Y MTODOS PCR


Para las reacciones de PCR se utiliz un termociclador (Applied Biosystems, modelo 9700) Un ciclo a 94 C por 60 segundos 35 ciclos [94 C por 30 segundos 40 C a 30 segundos y 72 C por 90 segundos] 72 C por 2.5 minutos.
Productos de PCR

Marcador de peso molecular 1 Kb (Fermentas)

Programa Kodak Digital Science 1D V.2.0.3;

Nitrato de plata 0.2 %, se fotodocumentaron

Geles de acrilamida 8 % utilizando 230 volts en amortiguador TBE 1X

Matriz binomial

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MATERIALES Y MTODOS Anlisis Estadstico


Matriz binomial Anlisis de agrupacin (anlisis cluster) Mtodo de aglomeracin UPGMA (media no ponderada) Corroborar la congruencia taxonmica

Todos los anlisis fueron realizados con NTSYSpc ver 2.2 (Rohlf, 2000).

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RESULTADOS Y DISCUSIN
Obtencin de DNA

Protocolo de extraccin (Sambrook et al. 1989) Doble fenolizacin de las muestras Utilizar mayor cantidad de RNAsa
Evidencio el activo metabolismo en el estado larvario de los insectos

Se obtuvo de larvas vivas y no de las suministradas por los laboratorios por motivos de seguridad. Sin lograr un resultado EFICIENTE.

Universidad de la Amazonia Programa de Biologa Molecular Productos de RAPD-PCR .

RESULTADOS Y DISCUSIN

Universidad de la Amazonia Programa de Biologa Molecular Productos de RAPD-PCR

RESULTADOS Y DISCUSIN

Universidad de la Amazonia Programa de Biologa Molecular Productos de RAPD-PCR

RESULTADOS Y DISCUSIN

Universidad de la Amazonia Programa de Biologa Molecular Productos de RAPD-PCR

RESULTADOS Y DISCUSIN

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RESULTADOS Y DISCUSIN
Individuos identificados

Anastrepha ludens El iniciador OPC-05 GATGACCGCC El iniciador OPC-10 TGTCTGGGTG

Anastrepha oblicua

Anastrepha striata

4
15

9
6

25
15

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RESULTADOS Y DISCUSIN

Comparacin entre los iniciadores COP 5 Y COP 10

Vs

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RESULTADOS Y DISCUSIN

Comparacin entre los iniciadores COP 5 Y COP 10

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RESULTADOS Y DISCUSIN
Otras apreciaciones

la eficiencia de los RAPDs en este trabajo tambin se debi a tres aspectos importantes: la calidad del DNA finalmente obtenido, la temperatura de alineamiento utilizada (40 C en lugar de 35-37C), lo que hace ms reproducibles las amplificaciones de PCR porque se incrementa la especificidad de los iniciadores,

El anlisis de los productos de PCR separados en geles de acrilamida, lo que nos permiti obtener y considerar hasta 3 veces ms datos informativos.

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CONCLUSIONES
La tcnica RAPD es una herramienta molecular altamente confiable para diferenciar especies del genero Anastrepha a nivel larvario. Fue posible diferenciar a las especies Anastrepha ludens, Anastrepha oblicua y Anastrepha striata con cualquiera de los iniciadores OPC-01, OPC-02, Del conjunto de iniciadores utilizados para la caracterizacin de las tres especies de moscas de la fruta, los iniciadores C-05 y C-10 resultaron ms adecuados para lograr su diferenciacin.