Fermentao Submersa

Thas Yumi Shinya thatays88@hotmail.com

Fermentao
Bioqumica Anaerbica No envolve a cadeia respiratria Industrial Pode ocorrer aerobicamente Obteno de bioprodutos

Fermentao
Bioqumica Anaerbica No envolve a cadeia respiratria Industrial Pode ocorrer aerobicamente Obteno de bioprodutos

Processo que ocorre quando o microrganismo se reproduz visando a obteno de um produto

Tipos de fermentao
Fcil manejo Menor custo Maior concentrao de produtos formados e maior controle de contaminantes Economia de gua, energia e espao Uso de resduos agroindustriais

Fermentao em Estado Slido (FES)

Fermentao Submersa (FSm)

Melhor controle do processo (pH, temperatura, oxignio) Facilidade de escalonamento Alta umidade Fcil recuperao do produto formado Fabricao comercial Homogneo

Resduos Agroindustriais

Grande potencial: produtos de alto valor agregado Bagao de cana: um dos maiores subprodutos acumulados Resduo lignocelulsico: Celulose,(fora e flexibilidade) lignina (resistncia) e hemicelulose (elo qumico), ligados covalentemente

Sticklen, 2008

Celulose

Polmero orgnico mais abundante e maior componente da biomassa vegetal Ligaes glicosdicas -1,4
a) b)

c)

a) monmero de D-glicose; b) celobiose; c) estrutura linear de celulose (ALBANO, 20

Fibrilas unidas por pontes de H Camadas adjacentes unidas por fora de Van der Walls Compacta
Rabelo, 2007.

Lignina

Unio das fibras Heteropolmero constitudo por unidades de fenilpropano Ligaes C-O-C que unem pequenas cadeias de hidrocarbonos: proteo fsica Fornece suporte estrutural

Rabelo, 2007.

Hemicelulose

Carboidratos polimricos Xilana, xiloglicana, glicomanana, galactoglicoman ana e arabinogalactana Vrias enzimas para degradao
Albano, 2012.

Enzimas celulolticas

Complexo de enzimas hidrolticas e oxidativas Catalisam a celulose em monmeros de D-glicose Pouco estudos com leveduras celulolticas

Trichoderma sp.

Aspergillus sp.

Fusarium sp.

Penicillium sp.

Celulases

Endoglucanases

Exoglucanases
-glucosidases

Sinergismo

Martins, 2005.

Enriquecimento proteico do bagao de cana

Outro destino para os resduos: rao animal Fungos, bactrias, algas: aditivos alimentares Cultivo direto em resduos Atraente fonte de: protena, aa, vitaminas, minerais, enzimas

Pleurotus ostreatus Candida utilis

Rhizopus sp.

Saccharomyces cerevisiae

Objetivo

Cultivar leveduras em bagao de cana-de-acar a fim de aumentar o teor de protenas e minerais do resduo, alm de produzir enzimas celulolticas, xilanolticas e amilolticas.

Metodologia

Repique em meio PDA (incubao em estufa 28C 5 dias)

Padronizao (106 cls/mL)

Incubao em Shaker (28C, 180 rpm, 5 dias)

Inoculao em fermentador (Condies a definir)

Repique

Potato Dextrose Agar (PDA): 3,9%

Padronizao do inculo
7 mL de H2O Retira-se 1 mL para contagem em Cmara de Neubauer X mL

Agitao para desprendiment o das clulas

Padronizao
Cmara de Neubauer

4x

Padronizao
Cmara de Neubauer

4x

Padronizao
Cmara de Neubauer

4x

Padronizao

n clulas/mL (Ci)= Mdia dos 5 quadrados x 25 x 104 x FD FD = total/amostra CiVi = CfVf Vi = x Cf = 106 Vf = 50 mL

Padronizao

n clulas/mL (Ci)= Mdia dos 5 quadrados x 25 x 104 x FD FD = total/amostra CiVi = CfVf Vi = x Cf = 106 Vf = 50 mL

Padronizao

n clulas/mL (Ci)= Mdia dos 5 quadrados x 25 x 104 x FD FD = total/amostra CiVi = CfVf Vi = x Cf = 106 Vf = 50 mL

Incubao em Shaker

Composio do meio de cultura:

Bagao modo: 5% (na primeira prtica no usaremos bagao) Extrato de levedura: 0,2% Sacarose: 1% (NH4)2SO4 : 0,1% (NH4)3PO4 : 0,13% K2SO4 : 0,031% ZnSO4x7H2O: 0,0028% MnSO4xH2O :0,0012% MgSO4x7H2O: 0,024%

Condies: 50 mL, 28C, 180 rpm, 120 h

Inoculao no fermentador

Meio e calibrar sensores no dia anterior Condies a definir

Procedimentos analticos

Amostras: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48, 72 h Quantificao celular

Contagem direta (Cmara de Neubauer): 1 mL n clulas/mL = dos quadrantes x 5 x 104 x FD

Biomassa seca (g/L)

Centrifuga 2500 rpm 20 min

Sobrenadante: AR e extrato enzimtico

20 mL de amostra

Precipitado: secar em estufa at peso cte

Estacionri a Declnio

Log

Lag

Estacionri a Declnio

Log

Lag

Adaptao

Estacionri a Declnio

Log

Crescimento exponencial

Lag

Adaptao

Equilbrio

Estacionri a Declnio

Log

Crescimento exponencial

Lag

Adaptao

Equilbrio

Estacionri a Declnio
Esgotamento dos nutrientes

Log

Crescimento exponencial

Lag

Adaptao

Procedimentos analticos

Velocidade especfica mx de crescimento

Rendimento celular (Yx/s)

Yx/s = X Xo

So S

Quantificao de AR

DNS (Miller, 1959)

reduo do cido 3,5-dinitrosaliclico e a oxidao do acar redutor, formando o cido 3-amino-5- nitrosaliclico
Redu o

c. 3,5-dinitrosaliclico

c. 3-amino-5-nitrosaliclico

0,5 mL DNS 5 min 100C 0,75 mL extrato 5 min banho de gelo +3,75 mL H2O Leitura a 540 nm

FPase

Mandels et al. (1976) Endo e exoglucanases Substrato papel filtro Whatman n 1 1 FPU: liberao de 1 mol de acar redutor/min/mL de enzima

0,016 g de papel picado 1 mL tampo acetato 0,2 M, pH 5,6 0,5 mL extrato 0,75 mL 50C, 60 min

0,5 mL tampo 0,25 mL extrato

Branco: 0,75 mL tampo

DNS

CMCase

Ghose (1987) Endoglucanase Substrato: Carboximetilcelulose (CMC) 0,5 % (p/v), pH 5,6 U/mL: 1 mol de acar redutor liberado/min/mL de enzima

Reao: 0,65 mL CMC 0,1 mL extrato

Controle do substrato: 0,65 mL CMC 0,1 mL tampo 10 minutos, 50C

Controle da enzima: 0,65 mL tampo 0,1 mL extrato

Branco 0,75 tampo

5 min banho de gelo

DNS

Xilanase

Brienzo et al. (2009) Substrato: xilana 0,5 % (p/v), pH 5,6 U/mL: 1 mol de acar redutor liberado/min/mL de enzima a partir da xilana

Reao: 0,65 mL xilana 0,1 mL extrato

Controle do substrato: 0,65 mL xilana 0,1 mL tampo 10 minutos, 50C

Controle da enzima: 0,65 mL tampo 0,1 mL extrato

Branco 0,75 tampo

5 min banho de gelo

DNS

Amilase

Escaramboni (2014) Substrato: amido 0,5 % (p/v), pH 5,6 U/mL: 1 mol de acar redutor liberado/min/mL de enzima a partir do amido

Reao: 0,65 mL amido 0,1 mL extrato

Controle do substrato: 0,65 mL amido 0,1 mL tampo

Controle da enzima: 0,65 mL tampo 0,1 mL extrato

Branco 0,75 tampo

10 minutos, 60C

5 min banho de gelo

DNS