INTRODUCCION

2
2
' t
L p D r
v
A C F =
g V E
p L
= g V P
p p
=
E P F
r
=
( )
2
1
'
2
(
(

=
D L p
L p p
t
C A
g V
v

A
p
: rea proyectada de la partcula en al direccin
perpendicular a su trayectoria
C
D
: coeficiente de arrastre, es funcin de Re
p
Vp: volumen de la partcula

L
: densidad de la fase lquida

p
: Densidad de la partcula
v
t
: velocidad terminal de partcula
F
r
E
R

P
F
c
P
R
a
c
g
g
e

( ) | |
2
1
2
2 2
2
R g g
R a
e
c
e
e
+ =
=
2
2
' ' ' tc
L p D r
v
A C F =
e p L
g V E =
'
( ) ( ) ( )
2
2
2
2
2
e p p p p p p R
g V R V g V P e = + =
' '
E P F
R r
=
( )
2
1
' '
2
(
(

=
D L p
e L p p
tc
C A
g V
v

SEDIMENTACION LIBRE CENTRIFUGACION
v
tc
: velocidad terminal de partcula en
centrifugacin
g
e
: gravedad eficaz
R: radio de giro, se adopta igual para todas las
partculas
: velocidad angular

C
D
se evala a v
tc
F
r
P
E
E: Empuje hidrosttico
F
r
: Fuerza de roce viscosa
P: Peso

F
c
: Fuerza centrfuga
Rgimen
(modelo)
Rango Re
p
C
D
Laminar
(Stokes)
< 0.5
Intermedio
(Allen)
0.5 - 500
Tubulento
(ley de Newton)
1000 - 200000
p
Re
10
p
Re
24
445 . 0
L
p t L
p
d v

= Re
Fluido en reposo,
entonces se adopta
para el modelo que
las partculas estn
quietas y el fluido se
acerca con v =v
t
R
v
S
t
2
e
= Se define al coeficiente de sedimentacin como:

Usualmente es un nmero muy pequeo, por lo que se lo expresa en
Svedbers (1 Svedber = 10
-13
segundos)
Para partculas no esfricas se hace necesario implementar el dimetro equivalente
de partcula.
p s ep
d d u = = u
s
Area de una esfera de igual volumen que la partcula
Area externa de la partcula

CLASIFICACION
Analtica

Preparativa
Diferencial
Con gradiente de densidad
Zonal
De equilibrio
CENTRIFUGACION ANALITICA
Aplicable a sustancias puras o mezclas simples
V
r
100000 rpm
Rotores con cmaras horizontales y detectores pticos
c
x
t
1
t
2
t
1
t
2
c vs x paramtricas en t
frente
IDENTIFICACION POR SU VALOR NEGATIVO
PUREZA POR SU VALOR NEGATIVO
ESTIMACION DE COEFICIENTES DE SEDIMENTACION
ESTIMACION DE COMPOSICIONES EN MEZCLAS DE PARTICULAS
dc
dx
x
t
1
t
2
dc/dx vs x paramtricas en t
frente
t
1
t
2
CENTRIFUGACION DIFERENCIAL
S < S < S
pellet
Centrifugacin
Es el mtodo ms comn de separacin, y es rara la purificacin enzimtica que no lo
utiliza. En este mtodo, el tubo de centrfuga se llena con una mezcla uniforme problema.
Tras la centrifugacin se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material
sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. El mtodo es bastante
inespecfico, y a priori no se puede saber si la partcula buscada quedar en el
sobrenadante, en el pellet o repartido entre ambos; sin embargo es una tcnica muy til,
sobre todo para aislamiento de clulas y orgnulos subcelulares.
GRADIENTES DE DENSIDAD
Un gradiente de densidad es un solvente distribuido con diferentes concentraciones en
una columna en donde la parte inferior es la positiva por contener el solvente con
mayor densidad. El fluido del gradiente de densidad consiste de un adecuado soluto de
bajo peso molecular en un solvente en el cual las partculas de la muestra pueden ser
suspendidas.
Clasificacin
Lineales


No lineales
Discontinuos
Continuos
Continuos
Consideraciones en los parmetros
del gradiente

El material que se emplea para establecer el gradiente.
La fuerza inica.
La viscosidad.
Las caractersticas osmticas.
La pendiente del gradiente.
El pH.
La presencia de agentes estabilizantes tales como
mercaptanos; EDTA, substratos enzimticos y
magnesio.

GRADIENTES DE DENSIDAD LINEALES
DISCONTINUOS
La densidad aumenta linealmente con el incremento en la distancia
desde el centro de rotacin.
El mtodo ms usado para formar gradientes
discontinuos es comenzar con la solucin ms
densa y colocarlas en capas de menor densidad
sucesivamente, evitando efectos de mezcla y
oclusin de aire.
tope fondo
x

L
tope fondo
x

L
Gradiente de densidad
discontinuo
Gradiente de densidad discontinuo
debido a efectos difusionales a un
cierto t
CONTINUOS
Los gradientes continuos pueden ser hechos a partir de gradientes
discontinuos, de tal manera que los lmites entre las capas comienzan
a desaparecer en la medida que los solutos difunden, as las
discontinuidades comienzan a linealizarse y en un tiempo suficiente la
densidad se volver completamente uniforme. Una forma de hacerlo
es rotando cuidadosamente el tubo de una posicin vertical a una
horizontal, bajo estas condiciones un gradiente discontinuo se
convertir en continuo en menos de 1 hora.
tope fondo
x

L
Gradiente de densidad
continuo
FORMACION DE UN GRADIENTE DE DENSIDAD CONTINUO A PARTIR
DE UNO DISCONTINUO POR DIFUSION
tope fondo
x

L
Gradiente escalonado a t=0
Gradiente suavizado por efectos
difusionales a t=t
Gradiente linealizado a t=t
Consideraciones para la formacin de gradientes de densidad
El intervalo de densidad utilizado debe ser suficiente como para separar las partculas de inters,
sin forzar al rotor.
El soluto no debe ser ni hiperosmtico ni hipoosmtico si la muestra a separar es sensible a la presin osmtica.
El soluto debe interferir con el mtodo de ensayo empleado para caracterizar las fracciones obtenidas.
El soluto debe poder ser eliminado del producto purificado.
No debera de absorber luz UV o en el rango visible.
Debera de ser barato y de fcil adquisicin, y en caso de ser caro, debera de se recuperable.
Debera de ser esterilizable.
No debera de ser corrosivo para el rotor.
No debera de ser ni txico ni inflamable.
GRADIENTES DE DENSIDAD NO LINEALES
Gradientes de densidad no lineales
tope fondo
x

L
No siempre es posible usar un gradiente lineal, en algunos casos
para la resolucin particular de algunas especies sedimentantes
puede ser necesario un perfil ms complejo.
Para generar este tipo de gradientes es posible utilizar cmaras continuas o
mezcladores de gradientes los cuales permiten la formacin de hasta seis gradientes de
una sola vez.
Mezclador de
gradientes
Sacarosa. Disacrido ampliamente empleado en la separacin y purificacin de materiales biolgicos mediante
centrifugacin zonal. Sin embargo presenta una alta viscosidad, lo que no le permite alcanzar grandes densidades. La
molcula es adems osmticamente activa, por lo que no es la ms adecuada para aislar clulas o componentes celulares.
Por lo dems es barata y de fcil adquisicin. Otras de sus ventajas es su carcter no inico. Se utiliza en el estudio de
protenas.

Ficoll. Polisacrido sinttico de alto peso molecular (400 kDa). Presenta un alto contenido en grupos hidroxilo por lo que
tiene una buena solubilidad en medios acuosos. Adems no presenta grupos ionizables que puedan servir de unin a las
muestras. Es estable a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin degradarse, no altera la presin osmtica del
medio. Debido a sus propiedades, el ficoll se ha utilizado para la separacin de clulas y partculas subcelulares mediante
centrifugacin zonal.

Percoll. Suspensin de partculas (5.15 nm) de cido silcico revestidas de un derivado de polivinilo (polivinilpirrolidona,
PVP) que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta prcticamente a la presin osmtica del medio y es estable a
pH comprendidos entre 5 y 10. Es soluble en solucin acuosa y estable en ellas siempre que no haya aniones bivalentes
(sulfato), especialmente a bajos pH. El compuesto puede ser utilizado para centrifugaciones zonales, preformando
gradientes, o bien para centrifugacin isopcnica, ya que la centrifugacin de percoll en rotores angulares durante 20-30
minutos y 20.000-100.000g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial del percoll.

Separacin de clulas
sanguneas humanas en
un gradiente de percoll
Clulas mononucleares

Clulas polimorfonucleares

Glbulos rojos
Aislamiento de
linfocitos humanos
usando un
gradiente de ficoll
Linfocitos
FORMACION DE GRADIENTES: SOLUTOS
CENTRIFUGACION ZONAL Y DE EQUILIBRIO
CENTRIFUGACION ZONAL
CENTRIFUGACION DE EQUILIBRIO
Siembra Causa de la separacin
En la parte superior de
un gradiente preformado
Diferencia entre las velocidades
terminales de las partculas
debido a sus masas diferentes
Siembra Causa de la separacin
En solucin isocrtica
Equilibrio isopcnico entre las
partculas y el solvente a un
determinado x

L
(tope)

L
(fondo)

S < S
Centrifugacin

L
(tope) <
L
(fondo) < ,
t
1
t
2
Centrifugacin
Requisitos del gradiente

L
(tope)

L
(fondo)

Centrifugacin

L
(tope) < < <
L
(fondo) Requisitos del gradiente
Centrifugacin
t
1
t
2
CENTRIFUGA DE LABORATORIO

Pequeo tamao.
Velocidad: 5000 rpm mximo.
Sin sistemas auxiliares.
til para partculas grandes
(clulas, precipitados de sales
insolubles).
MICROFUGAS

Velocidad: ms de 10000 rpm.
Tubos cortos.
Sin sistemas auxiliares.
Volmenes muy pequeos.
tiles en Biologa Molecular.
CENTRIFUGA DE ALTA VELOCIDAD

Velocidad: 18000 - 25000 rpm.
Sistemas auxiliares: sistemas de refrigeracin,
algunas con sistema de vaco.
tiles en la separacin de fracciones celulares.
Insuficientes para la separacin de ribosomas,
virus o macromolculas.
ULTRACENTRIFUGA

Velocidad: a partir de 50000 rpm.
Sistemas auxiliares: sistemas de refrigeracin, sistemas
de alto vaco.

Analticas: obtencin de datos precisos de propiedades
de sedimentacin (S, PM).
Preparativas: aislamiento de partculas de bajo S
(microsomas, virus, macromolculas).

CENTRIFUGAS