Aula HPLC2

Cromatografia lquida
de alta eficincia
Vantagens da HPLC
Versatilidade
Sensibilidade
Resultados quantitativos
Espcies no-volteis e termolbeis
Automatizao

Limitaes da HPLC
Alto custo do instrumento
Alto custo de operao
Falta de detector universal sensvel
Necessidade de experincia no seu manuseio
HPLC x GC
Fator GC HPLC
Requisito p/ amostra
voltil e termicamente
estvel
solvel na fase mvel
Tipos de amostra gases, lquido e slidos lquidos e slidos
Quantidade mnima
detectvel
10
-12
g (ECD) 10
-9
g (UV)
Tempo de anlise
minutos at poucas
horas
minutos at muitas
horas
Pratos tericos por
coluna
2.000-300.000 500-25.000
Capacidade analtica at 200 componentes at 50 componentes
Tempo de treinamento
do operador
cerca de 3 meses pelo menos 6 meses
Comparao entre as caractersticas de GC e HPLC
ESCOPO DA
CROMATOGRAFIA A
LQUIDO
Figura 28-1 Skoog p642 vp
espcies MM>10
4
:
cromatografia por excluso
espcies inicas de baixa
MM: cromatografia por
troca inica
espcies pequenas e
polares, mas no-inicas:
mtodos de partio
(srie homloga)
espcies no-polares:
cromatografia por adsoro
(ismeros estruturais,
hidrocarbonetos alifticos)
TROCA
INICA
PARTIO ADSORO
fase
normal
fase
reversa
EXCLUSO
filtrao
em gel
permeao
em gel
insolvel em gua solvel em gua
no-polar inico
polar no-inico
POLARIDADE DO SOLUTO
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
m
a
s
s
a

m
o
l
e
c
u
l
a
r

aplicaes
Instrumentao para HPLC
Fase mvel
Injetor
Caractersticas da fase mvel
Ser de alto grau de pureza ou fcil purificao
Dissolver a amostra sem decompor seus
componentes
No decompor ou dissolver a fase estacionria
Ter baixa viscosidade
Compatvel com o tipo de detector
Polaridade adequada para permitir a
separao dos componentes da amostra.
Sistema de bombeamento
REQUISITOS:
Presses de at 6000 psi (~400 atm)
Vazo contnua, sem pulsos (ou, se pulsando,
com amortecedor de pulsos)
Vazes de 0,1 a 10 ml/min (aplicaes analticas)
e
Controle de vazo e reprodutibilidade melhor que 1 %
Inrcia qumica: componentes resistente
corroso

Sistema de bombeamento
Tipos de bombas:
Pneumtica
Deslocamento
Recproca
Bomba pneumtica
Vantagens:
Baixo custo
Livre de pulsaes
Desvantagens:
Baixa presso (at 2000 psi)
Baixo volume
No permite gradiente
Vazo depende da presso de retorno e
viscosidade da fase mvel

Bomba de deslocamento
Vantagens:
Vazo independe da presso de retorno e
viscosidade da fase mvel
Livre de pulsaes
Desvantagens:
Baixo volume
No permite gradiente

Bomba recproca
Vantagens:
Presso elevada (at 10 000 psi)
Pequeno volume interno (35 a 400 L)
Permite gradiente
Desvantagem:
Fluxo pulsado
Alto custo

Sistema de Injeo
Loop de 0,5 a 500 L
Permite operar at 7000 psi
Reprodutvel

Sistema de Injeo
Coluna
Geralmente em ao inox
Coluna de vidro reforado (at 600 psi)
Coluna empacotada
Preo: > US$ 200.00

Pr-coluna
Pequena e de constituio similar da
coluna analtica
Retm:
Material particulado
Contaminantes do solvente
Componentes da amostra que se ligam
irreversivelmente fase estacionria.
Custo reduzido

Caractersticas de um detector
Sensibilidade e seletividade adequada
Ampla faixa linear
Baixo volume interno
Resposta Rpida
Boa estabilidade e reprodutibilidade
No destruir a amostra

Sensibilidade adequada

Nem sempre desejvel alta sensibilidade

A sensibilidade deve ser compatvel com a
concentrao do analito na amostra.

Seletividade adequada
Detector seletivo:
Permite detectar uma de duas ou mais espcies que
co-eluam.
Em geral, melhor linha base.
Detector no seletivo:
Uso universal
Linearidade por vrias ordens de grandeza
Faixa linear aquela regio da curva de calibrao que se
ajusta bem a uma reta.

Uma ampla faixa linear permite:
maior comodidade no dimensionamento do volume de
amostra.
acomodar em uma mesma corrida cromatogrfica picos
referentes a espcies de concentraes muito diferentes.
Baixo volume interno
O volume do detector a regio do fluxo
cromatogrfico ao qual o detector responde.
Grande volume alargamento dos picos
registrados.
Resposta Rpida

O sistema de deteco deve idealmente apresentar
um sinal que represente um exato instante de uma
poro do caminho (volume do detector).

Detector lento picos deformados (baixo e largo) e
com cauda longa.
Boa estabilidade e reprodutibilidade
Alta confiabilidade e facilidade de uso

No destruir a amostra para:
Permite coletar o eluato
Utilizar um segundo tipo de detector
Detector por espectrofotometria UV-
visvel
Detector por espectrofotometria
UV-visvel
Detector por arranjo de diodos
Detector por arranjo de diodos
Detector por espectrofotometria UV-
visvel
Princpio de operao Absorvncia de luz na faixa UV-visvel
tipo Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10
-9

Sensib. a temperatura Baixa
Sensib. a vazo da f. mvel No
til com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos que absorvem no selecionado
Detector por fluorescncia
Detector por fluorescncia
Princpio de operao
Excitao com luz produz emisso
fluorescente
tipo Altamente seletivo
-9
(excitao a laser: 10
-12
)
Sensib. a temperatura Baixa
til com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos ou derivados que fluorescem
Detector por ndice de refrao
Detector por ndice de refrao
Princpio de operao Mudana no ndice de refrao da fase mvel
tipo
Universal, depende de propriedade da f.
mvel
-7

Sensib. a temperatura alta
til com gradientes No
Aplicabilidade Geral
Detector eletroqumico
Princpio de operao Oxidao ou reduo em potencial fixo
tipo
Seletivo, depende de propriedades do
composto
-12

Sensib. a temperatura Mdia
Sensib. a vazo da f. mvel Sim
Aplicabilidade Espcies que oxidam ou reduzem
Detector por condutividade eltrica
Detector por condutividade eltrica
Princpio de operao
Condutividade eltrica devida a presena de
ons
tipo
Seletivo, depende de propriedades do
composto
-8

Sensib. a temperatura Mdia
Sensib. a vazo da f. mvel Sim
Aplicabilidade Solues aquosas com compostos inicos
Lquido lquido: liquido depositado fisicamente
sobre uma superfcie slida. Ex: gua sobre slica
ou alumina.

Fase ligada: Ligaes covalentes. Ex: Si-O-
(CH
2
)
17
CH
3
(RP-18).
Cromatografia de partio
Cromatografia de partio
Mais de 90% das anlises atuais so realizadas
com fase ligada.
Fase normal x Fase reversa
Fase normal:
fase estacionria polar;
fase mvel apolar (n-alcanos, clorofrmio,
acetato de etila);
solutos neutros;
|polaridade soluto | t. reteno;
mecanismo reteno: adsoro
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL
Nos trabalhos pioneiros
usou-se fases altamente
polares, como gua e
trietilenoglicol adsorvidos
sobre slica ou alumina e
solventes apolares, como
hexano ou ter isoproplico,
eram usados como fase
mvel; por razes histricas,
este tipo de cromatografia
chamado de fase normal
Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a
sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando a polaridade da
fase mvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluio
Polaridade do soluto:
a > b > c
c b a
tempo
c b a
tempo
P
o
l
a
r
i
d
a
d
e

d
a

f
a
s
e

m
v
e
l

Partcula de slica
Fase Normal
Si
OH
silanol livre

Si-OH + R
3
SiCl Si-O-Si-(CH
3
)
2
R + HCl
Ciano (-C
2
H
4
CN)
Diol (-C
3
H
6
OCH
2
CHOHCH
2
OH)
Amina (C
3
H
6
NH
2
)
R =
Fase normal x Fase reversa
Fase reversa:
fase estacionria apolar;
fase mvel polar (tampes, gua, metanol,
acetonitrila, THF);
solutos apolares, no-inicos;
|polaridade f. mvel | t. reteno;
mecanismo reteno: interaes apolares com
radicais da coluna.
Fase estacionria
Fase ligada
Fase estacionria
Fase ligada
CROMATOGRAFIA POR PARTIO
Si-OH + R
3
SiCl Si-O-Si-R
3
+ HCl
Si-O-SiR
2
soluto cadeias do
hidrocarboneto
(C
18
)
partio
(solubilizao)
Obs. nas fases ligadas, tem-se tambm a possibilidade de adsoro
do soluto devido aos stios ativos (silanis residuais)
A slica tem aproximadamente 8M de
grupos Si-OH por m
2
. A cobertura superficial
por silanizao esta limitada a 4 M devido a
efeitos estricos. Os Si-OH restantes so
prejudiciais causando alargamento das
bandas devido a polarizao da superfcie.
Principalmente na anlise de analitos
bsicos. Reao com trimetilsilano (efeito
estrico reduzido -CH3) minimiza o problema
(encapados)
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Na cromatografia de fase
reversa, a fase estacionria
apolar, um hidrocarboneto
por exemplo (C18) e a fase
mvel relativamente polar
(gua, metanol, acetonitrila,
etc)
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a
sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da
fase mvel aumenta-se o tempo de eluio
a > b > c
a b c
tempo
a b c
tempo
P
o
l
a
r
i
d
a
d
e

d
a

f
a
s
e

m
v
e
l

Separao isocrtica e por gradiente
A eluio isocrtica feita com um nico solvente (ou mistura de
solventes). Se um solvente no propiciar uma eluio suficientemente
rpida de todos os componentes, ento pode ser utilizada uma eluio
por gradiente.
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Na cromatografia de fase
reversa, a fase estacionria
apolar, um hidrocarboneto
por exemplo (C18) e a fase
mvel relativamente polar
(gua, metanol, acetonitrila,
etc)
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a
sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da
fase mvel aumenta-se o tempo de eluio
a > b > c
a b c
tempo
a b c
tempo
P
o
l
a
r
i
d
a
d
e

d
a

f
a
s
e

m
v
e
l

Com base nas eluies isocrticas foi elaborado o gradiente a seguir.
Pode haver vrias formas de se separar um dado conjunto de analitos,
entretanto algumas informaes so essenciais para determinao do
modo de operao
ESCOPO DA
CROMATOGRAFIA A
LQUIDO
Figura 28-1 Skoog p642 vp
espcies MM>10
4
:
cromatografia por excluso
espcies inicas de baixa
MM: cromatografia por
troca inica
espcies pequenas e
polares, mas no-inicas:
mtodos de partio
(srie homloga)
espcies no-polares:
cromatografia por adsoro
(ismeros estruturais,
hidrocarbonetos alifticos)
TROCA
INICA
PARTIO ADSORO
fase
normal
fase
reversa
EXCLUSO
filtrao
em gel
permeao
em gel
insolvel em gua solvel em gua
no-polar inico
polar no-inico
POLARIDADE DO SOLUTO
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
m
a
s
s
a

m
o
l
e
c
u
l
a
r

Desenvolvimento de mtodos para
separaes em fase reversa
A RP adequada para separar misturas neutras de baixo peso molecular
ou compostos orgnicos carregados. Se os ismeros no ficarem bem
separados, recomendada a cromatografia em fase normal, porque os
solutos possuem interaes mais especficas e mais fortes com a fase
estacionria.
Critrios para uma separao adequada
0,5 < k < 20
2
2
c
m
Ld
t
F
= Se t
m
(t
0
) no pode ser observado pode ser estimado por:
L comprimento da coluna, d
c
dimetro da coluna e F vazo
Resoluo > 1,5 (para quantificao)
Otimizao com um solvente orgnico
A primeira mistura que deve ser tentada acetonitrila (ACN) gua.

A ACN tem baixa viscosidade e permite deteco no UV baixo 190 nm.

O metanol a segunda escolha como solvente orgnico, maior
viscosidade e UV 205 nm.

O tetrahidrofurano (THF) a terceira pois possui uma faixa de UV menos
til, lentamente degradado pela oxidao e se equilibra mais
lentamente com a fase estacionria.

As condies gerais esto apresentadas na tabela a seguir:
Otimizao de dois ou trs solventes orgnicos
Otimizado
30 % ACN 70 % tampo
Otimizar sistematicamente
ACN : tampo
32% de THF
Tentativa e erro
40 % MeOH
22% de THF
nomgrafo
Nomgrafo
Separao por gradiente
Volume de residncia: volume no qual so misturados os solventes e o
incio da coluna. Variam de 0,5 a 10 ml em diferentes sistemas.
Se o volume de residncia for 5 ml numa vazo de 1 ml/min o tempo de
residncia t
D
5 minutos. Uma mudana de solvente iniciada em 8 minutos
no alcana a coluna at 13 minutos.
Medida de t
D

Inicialmente vimos separao de 8 analitos que necessitou de cerca
de 120 minutos. Enquanto a fora do solvente foi suficientemente
baixa para resolver os dois primeiros pico 2 e 3 a eluio do ltimo
pico foi muito lenta.

Para manter a resoluo desejada, mas diminuir o tempo de anlise
foi selecionado o modo de gradiente segmentado. Os picos 1 a 3
foram separados com uma fora de eluente baixa (B a 30%). Entre t =
8 e 13 min. B aumentou linearmente de 30 para 455 para eluir os picos
do meio. Entre t = 28 e 30 min B aumentou de 45 para 80 % para eluir
os picos finais.
Use um gradiente se
Use a eluio isocrtica se
0, 25
G
t
t
A
>
0, 25
G
t
t
A
<
Uma mistura de 14 compostos foi submetida a uma separao por
gradiente RP, indo de 5 a 100 % de ACN com um tempo de gradiente de
60 min. A amostra foi injetada em t =tempo de residncia . Todos os
picos foram eludos entre 22 e 41 min.
a) A mistura adequada para eluio isocrtica ou por gradiente?
b) Se a prxima corrida for um gradiente, selecione a porcentagem inicial
e final de solvente e o tempo de gradiente.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80
Srie1
41 22
0, 317
60
G
t
t
A
= =
a)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 20 40 60 80
Srie1
40 a 70 em 60 minutos
b)
Avaliar k, Rs para tentar reduzir o tempo
Gravity Chrom.
Tsvett, 1903
Flash Chrom.
1978
HPLC 1952 UPLC 2004 (TLC) Paper
Chrom.
E a Histria continua ...
CROMATOGRAFIA POR ADSORO slido lquido
Si
OH
silanol livre
Si
OH
silanol germinal
HO
Si
OH
silanis associados
Si
OH
soluto

adsoro
(pontes de H)
CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA
stios ativos mais comuns nos trocadores de ctions:
grupo cido sulfnico -SO
3-
H
+
(cido forte) e grupo cido carboxlico
COO
-
H
+
(cido fraco)
stios ativos mais comuns nos trocadores de nions:
grupos amina terciria N(CH
3
)
3
+
OH
-
(base forte) e grupos amina
primria NH
3
+
OH
-
(base fraca)
Quando um trocador inico de cido sulfnico colocado em contato
com uma soluo aquosa contendo o ction C, o equilbrio de troca
estabelecido o seguinte:
x RSO
3
-
H
+
+ C
x+
(RSO
3
-
)
x
C
x+
+ x H
+
slido soluo slido soluo
analogamente, um trocador de nions interage com o nion A
segundo a reao:
y RN(CH
3
)
3
+
OH
-
+ A
y-
(RN(CH
3
)
3
+
)
y
A
y-
+ y OH
-
slido soluo slido soluo
FASES MVEIS MAIS COMUNS:
solues aquosas que podem estar tamponadas ou conter
quantidades moderadas de um solvente miscvel com gua
fora e seletividade so moduladas pelo tipo e concentrao dos
aditivos (sal e solvente)

FASES ESTACIONRIAS MAIS COMUNS:
resinas de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, na qual so
ligados grupos inicos
micropartculas porosas de slica recobertas com filme do trocador

em colunas supressoras de eluente
escolha bvia: detectores por condutividade que so altamente
sensveis, universais para espcies carregadas, respondem de forma
previsvel a mudanas de concentrao; simples de construo e
manuteno barata, fceis de serem miniaturizados e comumente
funcionam por longo tempo sem problemas
limitao sria: era necessria uma alta concentrao do eletrlito
(fase mvel) para eluir a maioria dos analitos inicos em um tempo
razovel; como conseqncia, a condutividade dos componentes da fase
mvel tendia a sobrepujar a dos analitos, reduzindo acentuadamente a
sensibilidade do detector
em colunas supressoras de eluente
o problema da alta condutncia do eluente foi resolvido com a
introduo da chamada coluna supressora de eluente, posicionada
imediatamente aps a coluna analtica de troca inica
a coluna supressora recheada com uma segunda resina de troca
inica que efetivamente converte os ons da fase mvel a espcies
moleculares de ionizao limitada, sem afetar os ons do analito
REAO NA COLUNA SUPRESSORA
quando ctions (analito) esto sendo separados, freqentemente
utilizado HCl como reagente eluente e a coluna supressora
uma resina de troca aninica na forma de hidrxido
o produto da reao no supressor gua
H
+
(aq) + Cl
-
(aq) + Resina
+
OH
-
(s) Resina
+
Cl
-
(s) + H
2
O
REAO NA COLUNA SUPRESSORA
na separao de nions (analito), eluentes comuns so carbonato
ou bicarbonato de sdio e a coluna supressora um trocador de
ctions na forma cida
Na
+
(aq) + HCO
3
-
(aq) + Resina
-
H
+
(s)
Resina
-
Na
+
(s) + H
2
CO
3
O EFEITO DA SUPRESSO
amostra: F
-
,
Cl
-
e SO
4
2-
eluente:
NaOH

coluna
analtica:
troca
aninica

coluna
supressora:
troca
catinica

NaF, NaCl e
Na
2
SO
4
em NaOH
HF, HCl e
H
2
SO
4
em H
2
O
Na
+
(lixo)
H
+
(regenerador)
tempo
S

F
-
Cl
-
SO
4
2-
S

F
-
Cl
-
SO
4
2-
rudo
SEM SUPRESSO
SUPRESSO
QUMICA
contra-
ons
OH
-
H
+
condutncia do
eletrlito
(microSiemens, S)
(
+
+
-
) C
G =
1000 O
concentrao
(mol/L)
constante da
cela (cm
-1
)
condutncia
equivalente inica
(S.cm
2
/eq)
Supressor-H
+
+ NaOH
Supressor-Na
+
+ H
2
O
exemplo
eluente: 5 mmol/L
Na+
= 50 S.cm
2
/eq
OH-
= 198 S.cm
2
/eq
O = 10 cm
-1
G = (50+198).5x10
-3
/10
4
= 124 S

G
H2O
= 0,05 S
(
+
+
-
) C
G =
1000 O
Na+
= 50 S.cm
2
/eq
H+
= 380 S.cm
2
/eq
F-
= 55 S.cm
2
/eq
Cl-
= 76,3 S.cm
2
/eq
1/2SO42-
= 79,8 S.cm
2
/eq
O = 10 cm
-1
G
NaCl
= (50+76,3).1x10
-3
/10
4
= 12,6 S
G
HCl
= (380+76,3).1x10
-3
/10
4
= 45,6 S

NaF, NaCl e
Na
2
SO
4
em NaOH
HF, HCl e
H
2
SO
4
em H
2
O
condutncia da banda do
cloreto aumenta 3,6 vezes
aps supresso
aps
supresso
exemplo
analito: 1 mmol/L
regenerao das colunas supressoras
inconveniente do uso de colunas supressoras: necessidade de
regenerao peridica (8-10h) para converter a coluna a sua forma
original cida ou bsica
uso de duas colunas supressoras: enquanto uma das colunas
usada como supressora (retm Na
+
, supressor
-
Na
+
), a outra
condicionada pela passagem do eluente (HX, supressor
-
H
+
); quando
a primeira coluna satura (7-12h), uma vlvula dirige o fluxo para a
segunda coluna e assim sucessivamente, e novamente o sistema
pode ser usado por mais 7-12 h.
membrana supressora
membrana supressoras
ELUENTE
ELUENTE
RSO
3
H RSO
3
H RSO
3
H
RSO
3
Na RSO
3
Na
RSO
3
Na
canal
externo
membrana
permevel
canal do
eluente
resina de
troca catinica
forte
R = alquilbenzeno de cadeia longa
tubo
membranas supressoras
coluna analtica
pr-
coluna
injetor
reservatrio
do eluente
SISTEMA DE
REGENERAO
coluna
supressora
(membrana)
bomba para
regenerante
bomba para
eluente
detector
RSO
3
Na
RSO
3
H
R = alquilbenzeno de cadeia longa
RSO
3
H
coluna de
troca
catinica
em coluna nica
equipamentos onde nenhuma coluna supressora usada
abordagem depende de pequenas diferenas de condutividade entre
ons eludos e os ons do eluente
para amplificar essas diferenas so usados trocadores de baixa
capacidade, tornando possvel a eluio de espcies de baixa
condutncia equivalente
um pouco menos sensvel e tem uma faixa mais limitada do que a
cromatografia com coluna supressora
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO
Resoluo baseada no tamanho efetivo dos componentes
da amostra:
limite de permeao: abaixo do qual todas as molculas de
menor tamanho so igualmente difundidas dentro dos poros
do material
limite de excluso: acima do qual todas as molculas so
muito grandes para penetrar os poros
somente podem ser separadas as molculas que se
encontram dentro dos dois limites
Fase estacionria
Bioafinidade:
fase estacionria: ligantes especficos;
fase mvel: tampes;
mecanismo de reteno: interaes por bioafinidade (chave-
fechadura);
Aplicao: protenas, hormnios, antgenos, anticorpos, cidos
nucleicos.

Fase estacionria
Colunas quirais:

fase estacionria: ciclodextrinas, teres de coroa;

fase mvel: tampes, solventes polares, seletores
quirais;

Fase estacionria
Colunas quirais:
Colunas para HPLC
Figura: colunas utilizadas para anlise de preparaes farmacuticas segundo a
USP XXV (n=35).
Espectrometria de massa
Ferramenta analtica capaz de medir a massa
molecular de um ou mais compostos
Composio elementar das amostras
Estruturas de molculas inorgnicas, orgnicas e
biolgicas
Composio qualitativa e quantitativa de misturas
complexas
Estrutura e composio de superfcies slidas
Razes isotpicas de tomos nas amostras
Watson, J.T., Introduction to mass spectrometry. 3 ed. 1997
1 espectrmetro de
massa
J.J. Thomson (1913)
http://masspec.scripps.edu/MSHistory/histpers.php
PARBOLA
ESPECTROGRFICA
ons separados pelas
suas diferentes
trajetrias parablicas
em campos
eletromagnticos e a
deteco era feita
atravs de chapas
fotogrficas
Espectrmetro de massa
Introduo
da amostra
Fonte
de ons
Filtro de
massas (m/z)
Deteco
Vcuo
Diagrama em blocos de um
espectrmetro de massas.
http://www.asms.org
gerao de
ons na fase
gasosa a partir
das amostras
ons gerados na
fonte so
separados de
acordo com sua
relao m/z
Quantificao
dos ons que
passam pelo
filtro de m/z
Diagrama em blocos de um
espectrmetro de massas.
local onde a
amostra
exposta fonte
de inonizao
Electrospray (ESI)
Principais caractersticas
ocorre presso atmosfrica;
transferncia de uma molcula carregada em fase lquida
para a fase gasosa;
tcnica de ionizao suave que permite que as
interaes no covalentes entre molculas que esto em
soluo sejam preservadas na fase gasosa;
amostras devem ser solveis em solventes de baixo ponto
de ebulio;
[M+H]
+
ou [M-H]
-
;
molculas com cargas mltiplas, [M+nH]n
+
, podem ser
formadas por este mtodo.

Cole, R.B.; In: Electrospray Mass Spectrometry; John Wiley & Sons,
New York, Inc Chinchester, (1997)
Electrospray (ESI)
Electrospray (ESI)
1- formao de um spray com
gotculas altamente carregadas
2- as gotculas carregadas so
liberadas atravs do Cone de
Taylor
3- um gs nebulisador (N
2
) auxilia
na liberao das gotculas
5- a densidade de carga superficial aumenta at atingir o limite de Rayleigh
6- a gotcula explode os ons so direcionados ao contra eletrodo, que apresenta
carga oposta, passam pelo analisador de massa e so detectados

h
t
t
p
/
/
:
w
w
w
.
w
a
t
e
r
s
.
c
o
m

Cole, R.B.; In: Electrospray Mass Spectrometry; John Wiley & Sons,
New York, Inc Chinchester, (1997)
3- as gotculas vo tendo seus
raios diminudos
http://www.acsu.buffalo.edu/~twood/nanospray.html
Electrospray (ESI)
O
O H
O OH
O
O
O H O H
O H
O H O composto sai da coluna do HPLC, passa para a fase gasosa
na fonte de ionizao eletrospray e entra no espectrmetro de
massas.
Ento a massa molecular (m/z) da espcie registrada.
Neste exemplo: Apigenina glicosilada (m/z = 431).
Fragmentao
Cela de coliso
O
O H
O OH
O
O
O H O H
O H
O H
OH
OH O
O H
O
m/z 268
m/z 431
A seguir o composto levado cela de coliso, onde se fragmenta e gera (neste
exemplo a apigenina) o restante do espectro de massas.
100 200 300 400
m/z
268
431
Apigenina Glicosilada Apigenina
Determinao de resduo de drogas em cdulas
3 mL de (9:1 (gua: acetonitrila)), com 1% de
cido frmico - 15 minutos de ultra-som.
Injeo no LC/MS QTrap
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Time, min
0.0
5.0e4
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
4.0e5
4.5e5
4.7e5
I
n
t
e
n
s
i
t
y
,

c
p
s

8.24
11.25
2.18
5.93
Nicotina
Lidocana
Cocana
Referncias bibliogrficas

http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html

SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.
Princpios de anlise instrumental. 5. Ed., 2002.

COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.
Introduo a mtodos cromatogrficos.
WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles
and practice. 1997.

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