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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS


BIOQUMICA I

PROTENAS: DETERMINACIN DE LA
ESTRUCTURA PRIMARIA

INTEGRANTES: CARPIO DIANA
GARCA CRISTIAN
MORA JESSICA

FECHA: 14 OCTUBRE 2013
IMPORTANCIA BIOMDICA
Las protenas son macromolculas fsica y funcionalmente
complejas, que desempean diversas funciones de importancia
vital.
Posee una red interna de protenas, el citoesqueleto, mantiene la
forma celular y la integridad fsica.

Los filamentos de actina y miosina forman la maquinaria contrctil
del msculo.
La hemoglobina transporta oxgeno, en tanto que los anticuerpos
circulantes buscan invasores extraos.
Las enzimas catalizan reacciones que generan energa,
sintetizan y degradan biomolculas, duplican y transcriben genes,
procesan mRNA, entre otras funciones. Los receptores permiten
a las clulas detectar y responder a hormonas y otras seales del
entorno.
Una protena tpica nace en la traslacin, madura a travs de
eventos de procesamiento postraslacionales como la protelisis
parcial, alterna entre estados de trabajo y reposo con la
intervencin de factores reguladores, envejece por oxidacin,
desamidacin, entre otros y muere al degradarse a los
aminocidos que la componen.
Un objetivo importante de la medicina molecular es la
identificacin de protenas cuya presencia, ausencia o deficiencia
se relaciona con enfermedades o estados fisiolgicos especficos
LAS PROTENAS Y PPTIDOS DEBEN
PURIFICARSE ANTES DE SU ANLISIS
Es esencial disponer de un estado muy puro de la
protena para determinar con detalle sus propiedades
fsicas y funcionales.
Las clulas contienen
miles de protenas
distintas, cada una en
cantidades variables por
lo que se necesita el
aislamiento de una
protena especfica en
cantidades suficientes
para poder analizarla.
MTODOS
CLSICOS
aprovechan las diferencias de
solubilidad relativa de las protenas
pH polaridad concentracin salina
Las separaciones cromatogrficas dividen las molculas en dos
fases, una mvil y otra estacionaria. Para la separacin de
aminocidos o azcares, la fase estacionaria, o matriz, podra ser una
hoja de papel de filtro (cromatografa en papel) o una capa de
celulosa, slice o almina (cromatografa de capa fina, TLC).

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Se emplea como fase estacionaria una columna que contiene
pequeas cuentas esfricas de celulosa, acrilamida o slice
modificadas cuya superficie se recubre, por lo comn, con grupos
funcionales qumicos.
Estas matrices de fase
estacionaria interactan con
protenas segn su carga,
hidrofobicidad y propiedades
de enlace de ligando. Se aplica
una mezcla de protena a la
columna y se hace pasar la
fase mvil lquida. Porciones
pequeas de la fase mvil, o
eluyente, se colectan conforme
salen.

CROMATOGRAFA DE PARTICIN
Las separaciones cromatogrficas en columna dependen de la
afinidad relativa de diferentes protenas para una fase estacionaria
determinada y para la fase mvil. El vnculo entre cada protena y
la matriz es dbil y transitorio. Las protenas que interactan con
mayor fuerza con la fase estacionaria se retienen por ms tiempo.
El tiempo que una protena se asocia con la fase estacionaria es
funcin de la composicin tanto de la fase estacionaria como de la
mvil. Por consiguiente, la separacin ptima de la protena de
inters de las otras protenas se logra mediante la manipulacin
cuidadosa de la composicin de las dos fases.
CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
POR TAMAO


La cromatografa de exclusin por tamao, o
filtracin en gel, separa las protenas con base en
sus radios de Stokes, el dimetro de la esfera que
ocupan cuando entran en la solucin. Una protena
alargada ocupa un volumen ms grande que una
protena esfrica de la misma masa, en gel en orden
descendente segn sus radios de Stokes.
Para la cromatografa por absorcin, la mezcla de protenas se aplica a
una columna en condiciones tales que la protena de inters se asocia con
la fase estacionaria de manera tan firme que su coeficiente de particin es
en esencia la unidad. Primero se eluyen y desechan las molculas que no
se adhieren. Luego las protenas se liberan en forma sucesiva mediante la
desorganizacin de las fuerzas que estabilizan el complejo protena-fase
estacionaria, la mayor parte de las veces por medio de un gradiente de
concentracin salina creciente. La composicin de la fase mvil se
modifica poco a poco de modo que las molculas se liberan en forma
selectiva y en orden descendente a su afinidad con la fase estacionaria.

CROMATOGRAFA POR ABSORCIN
las protenas interactan con la fase estacionaria mediante
interacciones carga-carga. Las protenas con una carga
positiva neta a un pH determinado se adhieren a las cuentas
con grupos funcionales cargados negativamente como
carboxilatos o sulfatos (intercambiadores de cationes). De
manera similar, las protenas con carga neta negativa se
adhieren a las cuentas con grupos funcionales con carga
positiva, por lo general aminas terciarias o cuaternarias
(intercambiadores de aniones).
Las protenas, que son polianiones, compiten contra los iones
monovalentes por el enlace con el soporte,
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO
Ya que la carga neta de una protena
se determina mediante el pH, la elucin
sucesiva de protenas se podra lograr
al cambiar el pH de la fase mvil. Otra
opcin es que una protena se someta
a ciclos consecutivos de cromatografa
de intercambio inico, cada uno a pH
distinto, de modo que las protenas que
coeluyan a un pH eluyan a diferentes
concentraciones salinas en otro pH.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO
R = depsito del lquido de
fase mvil que trabaja o
funciona por gravedad o
mediante una bomba

C = columna de vidrio o
plstico que contiene la fase
estacionaria.

F = colector de la fraccin
para reunir porciones,
denominadas fracciones, del
lquido eluyente en tubos de
ensayo separados.

Las protenas se separan con base en su tendencia a unirse a una
matriz de fase estacionaria recubierta con grupos hidrofbicos
Las protenas con superficies hidrofbicas expuestas se adhieren a
la matriz por medio de interacciones hidrofbicas que se incrementan
mediante una fase mvil de fuerza inica alta. Las protenas no
adherentes son las que se separan primero. La polaridad de la fase
mvil disminuye al bajar poco a poco la concentracin salina. Si la
interaccin entre la protena y la fase estacionaria es particularmente
fuerte, se podra agregar etanol o glicerol a la fase mvil para
disminuir su polaridad y debilitar an ms las interacciones
hidrofbicas
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
HIDROFBICO
Los pptidos se purifican mediante
cromatografa de alta presin de fase reversa
Las matrices de fase estacionaria de de
columna clsica son generalmente
esponjosos cuya compresibilidad limita el
flujo de la fase mvil, en HPLC se emplean
microcuentas de gel de slice o almina
incomprensibles, estos materiales permiten
el alto flujo y resolucin aumentada.
HPLC de fase reversa
Se hacen explotar una fase estacionaria
hidrofbica de polmeros alifticos de 3 a
18 tomos de carbono de longitud.

Se efecta elucin de mezclas de peptido
usando un gradiente de un solvente
orgnico miscible en agua como acetonitrilo
o etanol.
Evaluacin de pureza mediante
electroforesis.
El mtodo ms utilizado es el SDS-PAGE
electroforesis de gel de poliacrilmida, en
presencia de un detergente anionico (SDS)
duodecil sulfato de sodio.

en la electroforesis convencional se separan
debido a sus cargas electricas, en la SDS-
PAGE la poliacrilamida se polimeriza y se
forma una red tridimensional o matriz
porosa.
Accin de la SDS
Cuando la SDS se
desnaturaliza tiene la
posibilidad de unin a
dos enlaces peptdicos,
cuando se utiliza con 2-
mercaptoetanol para
reducir enlaces S-S o
romperlos separa
componente de
protenas multimricas
Enfoque isoelctrico
Se utilizan buufers y un
campo electrico aplicador
para generar un gradiente de
pH dentro de la matriz de
poliacrilamida, las proteinas
migran hasta encontrar su
punto isolelectrico (el pH
cuando la carga neta vale 0);
el IEF se usa de manera
frecuente para lograr una
electroforesis bidimensional.
La reaccin de Edman permite
secuenciar polipptidos.
El reactivo de
Edman
(fenilisotiocianato
) permite
secuenciar para
marcar el amino
terminal de un
polipptido.
CON LA ESPECTROSCOPIA DE MASAS SE
DETECTAN MODIFICACIONES COVALENTES
ESPECTROMETRA
DE MASAS (EM)
VELOCIDAD
SENSIBILIDAD
VERSATILIDA
D
REEMPLAZO
EDMAN
DETERMINAR
SECUENCIAS
DE PPTIDOS
Y PROTENAS
POR LA ADICIN O SUPRESIN DE PARTES DE
CARBOHIDRATOS, FOSFORILO, HIDROXILO U OTROS
GRUPOS SUMAN O RESTAN INCREMENTOS ESPECFICOS DE
MASA
DISCRIMINA MOLCULAS BASADAS SOLO EN SU
MASA
DETECTAR LOS CAMBIOS FSICOS SUTILES EN LAS PROTENAS QUE
OCURREN DURANTE EL CICLO DE VIDA DE UNA CLULA U ORGANISMO
SE VAPORIZA AL
VACO UNA
MUESTRA
LOS CATIONES
LOS DESVA A
TRAVS DE UN
CAMPO
MAGNTICO Y
LOS DIRIGE A UN
DETECTOR
SE REGISTRA LA
FUERZA
MAGNTICA
REQUERIDA PARA
DESVIAR LA
TRAYECTORIA DE
CADA ESPECIE
INICA SOBRE EL
DETECTOR
FUERZA MAGNTICA
PROPORCIONAL A LA MASA
INICA
REJILLA
ACELERADORA
ELECTROIMN
AJUSTABLE
CAMPO
MAGNTICO
DETECTOR
ESPECTROSCOPIA DE MASAS EN TNDEM
SIN NECESIDAD DE PURIFICAR LAS MUESTRAS,
ESPECTRMETROS CONECTADOS EN SERIE, SEPARA EL
PPTIDO POR DIFERENCIA DE MASA
LA GENMICA PERMITE IDENTIFICAR
PROTENAS A PARTIR DE CANTIDADES
PEQUEAS DE DATOS DE LAS SECUENCIAS
CONOCIMIENTO DE
LA SECUENCIA DEL
GENOMA
SE SIMPLIFICA LA TAREA PARA DETERMINAR
UNA SECUENCIA DE AMINOCIDOS DE UNA
PROTENA DERIVADA DEL DNA
ORF (MARCO DE
LECTURA ABIERTA)
CODIFICA A LA PROTENA, ESTA SE PUEDA
IDENTIFICAR EN ALGUNOS CASOS
SOLAMENTE CON CONOCER UN SEGMENTO
DE LA SECUENCIA DE AMINOCIDOS DE
SOLO 4 O 5 RESIDUOS DE LONGITUD PARA
IDENTIFICAR EL ORF CORRECTO
PROTEMICA Y PROTEOMA
PROTEMIC
A
IDENTIFICA EL COMPLEMENTO
ENTERO DE PROTENAS ELABORADAS
POR UNA CLULA EN DIVERSAS
CONDICIONES
PROTEOMA
CONJUNTO DE TODAS LAS PROTENAS
EXPRESADAS POR UNA CLULA EN UN
INSTANTE PARTICULAR, REPRESENTA
UN BLANCO MVIL DE DIMENSIONES
EXTRAORDINARIAS
LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Y LOS
CHIPS DE ARREGLO DE GENES SE UTILIZAN PARA
ESTUDIAR LA EXPRESIN DE PROTENAS
OBJETIVO DE
PROTEMICA
IDENTIFICAR PROTENAS CUYOS NIVELES DE
EXPRESIN SE CORRELACIONA CON HECHOS DE
IMPORTANCIA MDICA. SE SUPONE QUE LA
APARICIN O DESAPARICIN DE PROTENAS SE
RELACIONA CON UN ESTADO FISIOLGICO O
ENFERMEDAD ESPECFICA, LAS CUALES
PROPORCIONAN PISTAS ESENCIALES DE CAUSAS
Y MECANISMOS.
ELECTROFORESIS
BIDIMENSIONAL
SU VENTAJA ES QUE EXAMINA A LAS
PROTENAS POR SI MISMAS. UN MTODO
ALTERNATIVO Y COMPLEMENTARIO
UTILIZA ARREGLOS DE GENES,
DENOMINADOS CHIPS DE DNA, PARA
DETECTAR LA EXPRESIN DE mRNA QUE
CODIFICAN PROTENAS
LA BIOINFORMTICA AYUDA A
IDENTIFICAR LAS FUNCIONES DE LAS
PROTENAS
DESCUBRIR INFORMACIN DE POSIBLES PROPIEDADES,
ACTIVIDADES FISIOLGICAS Y MECANISMOS DE ACCIN DE
LAS PROTEINAS
INFERIR AL COMPARAR SU ESTRUCTURA
PRIMARIA CON LA DE PROTENAS
CONOCIDAS
RESUMEN
LAS PROTENAS SON POLMEROS DE AMINOCIDOS O POLIPPTIDOS (UNIDAD
BSICA ESTRUCTURAL), CUYA ESTRUCTURA PERMITE ENTENDER CMO CUMPLE
SUS FUNCIONES
LAS PROTENAS EXPERIMENTAN ALTERACIONES POSTRANSICIONALES QUE
INFLUYEN EN SU FUNCIN Y DETERMINAN SU DESTINO
EL MTODO DE EDMAN FUE REEMPLAZADO POR LA ESPECTROMETRA DE MASAS
(HERRAMIENTA SENSIBLE PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA PRIMARIA,
IDENTIFICAR MODIFICACIONES TRANSLACIONALES Y DETECTAR ANORMALIDADES
METABLICAS
LA CLONACIN DE DNA Y LA BIOLOGA MOLECULAR JUNTO CON LA QUMICA DE
PROTENAS CONSTITUYEN MTODOS QUE INCREMENTAN LA VELOCIDAD Y
EFICACIA PARA DETERMINAR ESTRUCTURAS PRIMARIAS DE PROTENAS
LA GENMICA, EL ANLISIS DE TODA LA SECUENCIA DE OLIGONUCLETIDOS DEL
MATERIAL GENTICO COMPLETO DE UN ORGANISMO, PRODUJO MEJORAS
ADICIONALES.