INVESTIGACIN Y RECUENTO DE Enterobacteriaceae LACTOSA +

(COLIFORMES)
Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo coli-aerogenes constituyen un grupo
de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por
criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por
su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos
rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin
comprendida entre 30-37C.
Oxidasa -
Glucosa
Acido y
gas
Fermentacin cido mixta, produce una
mezcla de cidos orgnicos: lctico,
actico, frmico y etanol, CO
2
y H
2
.
Prueba del Rojo de Metilo +.
Fermentacin butanodioica: acetil metil
carbinol o acetona precursor
intermediario del butanodiol. prueba de
Voges Proskauer +
Indol + RM + VP -
Citrato -
Reacciones en KIA Pruebas del INViC
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa
Tema 6
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes:
suelo, plantas, cscara de huevo, etc.

Aunque su especificidad como indicadores no es buena, se suelen usar como ndice de
contaminacin fecal por:

- Su frecuencia en heces.
- Su fcil deteccin en el laboratorio.
- Sus caractersticas semejantes, en algn aspecto, a las de algunos miembros patgenos de la
familia Enterobacteriaceae.

Dentr, de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y, por
consiguiente, los que ms interesan en el anlisis microbiolgico de alimentos.

Se considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coli. Sus principales
caractersticas son:

- Capacidad para desarrollarse entre 43,5-45,5 C.
- Capacidad para crecer en presencia de sales biliares.
- Facultad para producir indol en agua de peptona.

En general, niveles altos de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes) indican
manipulacin y elaboracin deficientes de los alimentos.
Investigacin y recuento de Enterobacterias lactosa +
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa
Tema 6
Investigacin y recuento de Enterobacterias lactosa +
Mtodo en medio lquido
Disolver. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en tubos de
ensayo con campana Durham a razn de 10 ml.
Esterilizar en autoclave a 121 C 20 minutos.
+ + + + - - - - -
Lectura: En las tablas del N.M.P. (tres series de tres tubos). Son
positivos los tubos que presentan gas en la campana Durham
Incubacin a 31C durante 24-48h.
10
-3
10
-2
10
-1

Suspension madre 1:10 TW
Caldo lactosado biliado verde brillante
(Brilliant Green Bile Lactose: B.G.B.L)
Peptona 10 g
Lactosa 10 g
Bilis de buey 20 g
Verde brillante 0,0133 g
Agua destilada 1.000 ml
B.G.B.L
1 ml 1 ml 1 ml
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa
Tema 6
Investigacin y recuento de Enterobacterias lactosa +
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa
Tema 6
1ml
Suspension madre 1:10 TW
10
-5
10
-4

10
-3

10
-2
10
-1

10 ml
Investigacin y recuento de Enterobacterias lactosa +
Las sales biliares y el cristal violeta del medio inhiben la flora
Gram+. La fermentacin de la lactosa hace que vire el indicador
rojo neutro a un color rojo prpura. Tambin se produce una
precipitacin de las sales biliares.
- Despus de depositada la siembra, verter, en cada placa 15 ml de
agar VRBA atemperado a 45 C.Mezclar, solidificar y aadir una
capa de VRBA en la superficie.
-Incubar a 31C durante 24 horas..
-Observacin y recuento de colonias tpicas: rojo prpura, rodeadas
de una zona de precipitacin color violeta
Agar biliado-rojo neutro-cristal violeta
(Violet Red Bile Agar: VRBA)

Extracto de levadura 3g
Peptona 7g
Cloruro sdico 5g
Sales biliares 10g
Lactosa 5g
Rojo neutro 0.03g
Cristal violeta 0.02g
Agar 15g
Agua destilada 1000ml
VRBA
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 6
Son bacilos Gram-, rectos, mviles, por flagelos peritricos o algunos inmviles. La gran
mayora poseen fimbrias para conjugacin
Presenta una serie de pruebas bioqumicas
caractersticas: IMViC (++--). No forma SH
2,

oxidasa- y catalasa-. Fermenta lactosa y glucosa
con gran produccin de cido y gas.
Glucosa +
Lactosa +
SH
2
-
Indol + RM + VP -
Pruebas del INViC
Citrato -
Se eliminan por las heces y son bastante resistentes a
las condiciones ambientales por lo que se utilizan
como ndice de contaminacin fecal en aguas y
alimentos
Oxidasa -
Investigacin y recuento de Escherichia coli
Tiene el inconveniente de vivir poco
tiempo en el ambiente, por lo que su
presencia en los alimentos indica
contaminacin reciente.
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa
Tema 7
Cepas enterotoxignicas (ECET).

Elaboran una toxina termolbil (LT) que se inactiva a 60C durante 30 minutos y/o
una toxina termoestable (ST) que resiste a ms de 100C durante 30 minutos. La
toxina termolbil es estructuralmente semejante a la toxina colrica.

Se localiza la bacteria en el intestino delgado elaborando toxinas que alteran las
clulas del epitelio del intestino delgado, destruyndolas, lo que ocasiona salida de
agua y electrolitos que se vierten a la luz intestinal originando una diarrea acuosa.

Originan diarrea infantil y la denominada diarrea del turista. Los sntomas se
inician entre las 8 y 48 horas de la ingestin del alimento y son diarrea acuosa, a
veces con mucosidad, dolor abdominal, nauseas, vmitos y si se origina fiebre, no
muy alta. A veces puede ser grave, semejante al colera. Son excepcionales en
nuestro pas, pero causan con gran frecuencia enteritis en paises subdesarrollados
del Prximo y Extremo Oriente, Africa y Centro y SurAmerica.
Investigacin y recuento de Escherichia coli
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 7
Investigacin y recuento de Escherichia coli
Cepas enteroinvasivas (ECEI).

Tienen caractersticas atpicas que las hacen semejantes a Shigella, ya que son
inmviles y no producen gas de la glucosa y fermenta la lactosa muy lentamente.
Tienen un potencial enteroinvasor semejante al de Shigella.

Las bacterias penetran en el intestino e invaden las clulas epiteliales del colon donde
se multiplican y destruyen ocasionando ulceraciones, lo que ocasiona diarrea
sanguinolenta. Es mas grave que la anterior. Los sntomas aparecen entre las 8 y 24
horas de la ingestin y son escalofros, malestar, dolor de cabeza, dolor abdominal,
diarrea sanguinolenta y fiebre. Dura varios das y semanas. No es demasiado grave y
es muy rara en nuestro pas.
Cepas enteropatgenas (ECEP).

Se les denomina cepas enteropatgenas clsicas por ser las que mas comunmente
ocasionan enteritis en nuestro pas. Ocasionan una patologa parecida a las cepas
enterotoxignicas. Son causantes de numerosos brotes en guarderas y otras
comunidades infantiles. Es mas frecuente en pases subdesarrollados con condiciones
higinicas deficientes. Se localizan en el epitelio intestinal pero no destruyen los
tejidos. Los sntomas aparecen entre las 17 y 72 horas y son dolor abdominal, vmitos,
fiebre , diarrea acuosa con abundante moco pero sin sangre. Dura entre 7 y 72 horas.
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 7
Colitis hemorrgica: dolor abdominal, con vmitos, diarrea acuosa y sanguinolenta y
poca o ninguna fiebre.
Sndrome hemoltico urmico: diarrea sanguinolenta y sobre todo en nios fallo renal
agudo que puede terminar en muerte. No hay fiebre.
Prpura trombtica trombocitopnica: No hay fiebre y hay diarrea hemorrgica, pero
se afecta el sistema nervioso central. Se producen cogulos en el cerebro y puede
ocasionar la muerte.
Cepas enterohemorrgicas (ECEH).
E.coli serovar O157:H7 pueden causar la
muerte. Producen verotoxina. Lesiona la
mucosa intestinal produciendo sangrado, sin
reaccin inflamatoria local.
Investigacin y recuento de Escherichia coli
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 7
Tubos positivos en B.G.B.L.
10 ml caldo B.G.B.L.
con campana Durham
Incubacin 44,5C, 24-28 h.
1 ml
Agar Levine
Tubos + (gas)
Incubacin 37C, 24 h.
Agar PCA
Incubacin 37C, 18-24 h.
Disolver. Ajustar el pH a 7,4. Distribuir en
tubos de ensayo con campana Durham a razn
de 10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 C 20
minutos.
Las colonias de E. coli sobre agar Levine miden 2-3 mm de dimetro, son planas o
ligeramente cncavas, con centros oscuros, casi negros, que ocupan las 3/4 partes de la
colonia. Con luz reflejada, se observa un brillo metlico verdoso; a veces, este brillo
metlico no se manifiesta.
Rojo metilo + VP - Citrato - Indol +
I M Vi C
Pruebas confirmativas
Investigacin y recuento de Escherichia coli
Agar Levine EMB

Peptona 10 g
Lactosa 10 g
Fosfato dipotsico 2 g
Eosina 0,40 g
Azul de metileno 0,065 g
Agar 15 g
Agua destilada 1.000 ml
Caldo lactosado biliado verde brillante
(Brilliant Green Bile Lactose: B.G.B.L)
Peptona 10 g
Lactosa 10 g
Bilis de buey 20 g
Verde brillante 0,0133 g
Agua destilada 1.000 ml
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 7
Suspension madre 1:10 TSB
Se considera E. coli
- Si se ha producido gas por fermentacin de la
lactosa.
- Si se produce fluorescencia azul/verde por presencia
de la enzima $-D-glucuronidasa.
- Si la reaccin de indol es positiva.
10
-3
10
-2
10
-1

Caldo lauril sulfato (MUG)
Pruebas confirmativas
Prueba rpida para Investigacin de E. coli (MUG)
E. coli posee, junto con algunas especies de
Salmonella y Shigella, la enzima $-D-
glucuronidasa, que acta sobre el 4-metil-
umbeliferil-$-D-glucurnico (MUG) y libera
4-metil-umberiferona que emite fluorescencia
azul/verde cuando se ilumina con luz
ultravioleta.
MUG +
Identificacin de cepas ECEH
E. coli O157:H7
Sorbitol -
MUG -
Las cepas de E. coli enterohemorragicas, no dan
fluorescencia cuando se investigan por la tcnica
MUG. No fermentan el sorbitol y dan positiva la
prueba de aglutinacin en latex
Caldo lauril sulfato (MUG)
Triptosa 20 g
Lactosa 5 g
Cloruro sdico 5 g
Lauril-sulfato sdico 0,10 g
Fosfato dipotsico 2,75 g
Fosfato potsico 0,75 g
L-Triptfano 1 g
-D-glucurnico 0,10 g
Agua destilada 1000ml
1 ml 1 ml 1 ml
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 7
Prueba Reaccin
Movilidad + (casi siempre)
Indol +
Rojo de metilo +
Voges Proskauer -
$-galactosidasa +
Citrato de Simmons -
SH2 -
Lisina +
Urea -
Fermentacin de la glucosa +
Fermentacin de la lactosa +
Prueba Reaccin
Movilidad + Indol + RM +
VP -
LDC +
Urea -
-galactosidasa + Glucosa +
Lactosa +
SH
2
-
Citrato -
CARACTERSTICAS BIOQUMICAS DE Escherichia coli
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema7
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son microorganismos de forma bacilar,
Gram-, anaerobios facultativos, no esporulados, mviles o inmviles, que fermentan la
glucosa, reducen los nitratos a nitritos, son oxidasa- y crecen en medios que contienen
sales biliares. De los integrantes de esta familia, unos fermentan la lactosa y otros no.
Incluye los siguientes gneros:
Investigacin de Enterobacterias totales
No fermentadores de la lactosa Fermentadores de la lactosa

Salmonella Escherichia
Shigella Enterobacter
Edwarsiella Citrobacter
Hafnia Serratia (a veces)
Proteus Kelbsiella
Providencia
Yersinia
Morganella
Erwinia (fermenta excepcionalmente)

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 8
10
-3
10
-2
10
-1

Suspension madre 1:10 TSB
1ml
1ml 1ml
Agar VRBG
Incubacin 37C, 24 h.
Incubacin 37C, 24 h.
Colonias tpicas
Lectura en tablas NMP
Investigacin de Enterobacterias totales
Tcnica en medio lquido. NMP
Agar PCA
Pruebas confirmativas
Oxidasa - Kliger
Colonias rojo violeta rodeadas de un
halo rojo
Caldo EE de Mossel simple
Peptona 10 g
Fosfato sdico 6,50 g
Dextrosa 5 g
Fosfato potsico 2 g
Bilis de buey 20 g
Verde brillante 0,125 g
Agua destilada 1.000 ml
Agar biliado rojo violeta glucosa
(Violet Red Bile Glucose: VRBG)
Extracto de levadura 3 g
Peptona 7 g
Cloruro sdico 5 g
Sales biliares 1,50 g
Glucosa 10 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 12 g
Agua destilada 1.000 ml
Medio Kliger Iron Agar: KIA
Extracto de carne 3g
Extracto de levadura 3g
Peptona 20g
Cloruro sdico 5 g
Sulfato ferroso 0,30g
Tiosulfato sdico 0,30g
Lactosa 10g
Glucosa 1 g
Rojo fenol 0,05g
Agar 15g
Agua destilada 1.000 ml
EE Mossel
1 ml 1 ml 1 ml
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 8
Investigacin de Enterobacterias totales
Oxidasa -
Kliger
10 ml
Tcnica en medio slido
Agar VRBG
Incubar a 37C 24h. Contar colonias tpicas
Agar PCA
Pruebas confirmativas
Suspension madre 1:10 TW
10
-5
10
-4

10
-3

10
-2
10
-1

1 ml
Agar biliado rojo violeta glucosa
(Violet Red Bile Glucose: VRBG)
Extracto de levadura 3 g
Peptona 7 g
Cloruro sdico 5 g
Sales biliares 1,50 g
Glucosa 10 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 12 g
Agua destilada 1.000 ml
Oxidasa -
Kliger
Pruebas confirmativas
Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiologa y Parasitologa Tema 8