BIO10-329 Biofsica de Protenas

Regente: Clia R. Carlini

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Proteomas e Espectrometria de Massa
Principais componentes moleculares da bactria E. coli
Componentes N de molculas diferentes % peso total
H
2
O 1 70
Protenas 3.000 15
Ac. Nuclico 1 - DNA e 1000-RNA 7
Carbohidratos 50 3
Lipdeos 40 2
Outros ons - 12 3
Mol. Monomricas - 500
A tabela mostra a percentagem em peso dos principais tipos de molculas presentes
em um clula simples, a bactria Escherichia coli. Observe que as protenas compem o
grupo mais diverso de molculas.

Antes das tcnicas de protemica, para se obter informaes sobre uma protena em
particular, era necessrio separ-la de todas as outras que esto presentes na mesma
fonte biolgica.

Atualmente, possvel analisar-se um grande conjunto de protenas ao mesmo
tempo, e obter informaes de uma protena em particular sem separ-la das demais,
graas s tcnicas de espectrometria de massa acoplada com eletroforese 2D e/ou
cromatografia lquida.
METABOLOMA - metablitos
GENOMA DNA 3,4 bilhes de nt
SIGNALOSOMA interaes entre protenas
de uma via de sinalizao
TRANSCRIPTOMA mRNA 30 mil genes
INTERACTOMA interaes entre protenas
PROTEOMA Protenas 0,3-1,2 milho protenas
Homo sapiens
Atualmente, a capacidade de processamento de grandes volumes de
informaes e tcnicas analticas de alta resoluo, entre as quais se
destaca a espectometria de massas, permitem o estudo de clulas e
organismos inteiros so os OMAS.
Estratgias experimentais
Do geral para o particular
Analisar diversos proteomas em
condies diferentes e identificar
as diferenas
Do particular para o geral
Analisar uma nica protena e
inferir suas funes no contexto
do todo
Separao de protenas nas amostras
Eletroforese bidimensional Cromatografia lquida (LC)
fragmentao
Determinao de massas para identificao
Peptide mass fingerprint Sequenciamento de novo
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL:
anlise simultnea de at 5.000 protenas
permite comparao de todas as protenas
expressas por uma clula em dois momentos
diferentes:
anlise do efeito de hormnios,
anlise do efeito de drogas;
estados fisiolgicos (desenvolvimento);
condies patolgicas diversas (vrus,
bactrias,etc.)

Eletroforese 2D de protenas
totais (proteoma) de clulas de
Escherichia coli
Protenas com mesmo pI
Protenas com a
mesma massa
Proteoma Comparativo ou Diferencial
condio condio
Sobreposio permite identificar diferenas nos padres de bandas
Sobreposio para anlise das protenas
diferentemente expressas
Protenas de cada condio so marcadas com tags fluorescentes
diferentes para facilitar a visualizao das diferenas
Interatoma de C. elegans
- protenas individuais, representadas por crculos, agrupam-se
(indicado por linhas) conforme suas interaes, formando uma rede que
permite entender detalhes do controle das funes vitais do organismo.
Identificao de Protenas por MS: 10 passos
Espectro de massas
dos fragmentos
virtuais
Tripsinizao
virtual
Banco de
seqncias
(i.e. SwissProt)
Banda removida
do gel
Fragmentar
com tripsina
Obter espectro
de massas dos
fragmentos
comparao
B
a
n
c
o

d
e

e
s
p
e
c
t
r
o
s

(1)
(2) (3)
(4)
Espectro de massas
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
Identificao
(10)
Peptide fingerprint ou impresso digital de peptdeos:
protenas so identificadas com base no tamanho dos
peptdeos resultantes da hidrlise com tripsina,
comparando-se o espectro de massa real com o terico,
obtido a partir dos bancos de dados de protenas.
1529 1 478
1529.7 0.1 164
1529.73 0.01 25
1529.734 0.001 4
1529.7348 0.0001 2
Massa/carga Mass Tolerance (Da) # Hits in Database
Quanto maior a exatido da medida de massas, maior a segurana na
identificao da protena (hits) que originou os peptdeos trpticos.
Impresso digital de peptdeos: efeito de peptdeos mltiplos
1529.73 0.1 204
1529.73
1252.70
0.1 7
1529.73
1252.70
1833.88
0.1 1
Massa/carga m/z Mass Tolerance # Hits Database
A identificao de mais de um peptdeo triptco de uma mesma protena
aumenta a confiabilidade da identificao dessa protena por
espectrometria de massa.
2 peptdeos
3 peptdeos
Thomson, 1897 fez descoberta do eltron e inventou a espectrometria de
massa, com a primeira medida da razo massa/carga de uma partcula.
Prmio Nobel de Qumica, 2002 foi para os inventores de mtodos de
ionizao branda em espectrometria de massa, que permitiu anlise de
macromolculas como protenas
John B. Fenn (E.U.A.) - Electrospray (ESI)
Koichi Tanaka (Japo) - Soft Laser Desorption (SLD).
Espectrometria de Massas
Espectrmetros de massas usam diferenas na razo massa-carga (m/z) de tomos ou
molculas ionizadas para separ-los, e/ou para determinar a composio e a estrutura
qumica. Molculas fragmentam-se de maneiras diferentes, sendo que a anlise MS dos
fragmentos permite sua caracterizao estrutural.

O poder de separao de ons de um MS descrito por sua resoluo, que definida
como:
R = m /D m sendo m, a massa do on
Dm, a diferena de massa entre dois picos no
espectro de massa

Ex: um MS com resoluo de 1000 consegue separar ons com m/z de 100.0 e 100.1
O espectro de massas de uma molcula
consiste de uma famlia de picos, correspondendo
a espcies carregadas que diferem de 1 unidade
de massa e carga.
A deconvoluo desses picos, gerando o
grfico acima, d a massa de uma molcula com
preciso de 0,01%
A massa de uma molcula pode
ser determinada a partir dos m/z
de quaisquer dois picos vizinhos,
que diferem por 1 carga (+) ou 1
prton:
(m/z)
1
= M + n
2
x
n
2
M a massa da molcula
n
2
o nmero de cargas
X a diferena entre dois picos
(m/z)
2
= M + (n
2
x +1)X
n
2
+ 1
Temos duas equaes e dois
desconhecidos, M e n
2
, que podem
ser calculados resolvendo-se esse
sistema de equao:
n
2
= (m/z)
2
X
(m/z)
2
(m/z)
1
M = n
2
[(m/z)
2
X]
MS de setor magntico:

Ionizao: um feixe de eltrons de alta energia utilizado para ejetar um eltron de
uma molcula, formando um radical catinico designado como on molecular. Se o on
molecular for muito instvel ele poder se fragmentar em ons menores.

Analisador de massa: os ons moleculares so focalizados, formando um feixe, so
acelerados atravs de um campo magntico, sendo defletidos (desviados) de acordo
com as massas dos ons.
Analisadores de massa
Analisadores de massa
Quadrupolo
- consiste de quatro eletrodos (tubos metlicos), dois positivos e dois negtivos. A
voltagem aplicada afeta a trajetria de ons passando atravs aos eletrodos. Para
uma dada condio de corrente e voltagem, somente ons com uma dada razo
massa/carga seguem o trajeto entre os tubos, e todos os outros so desviados para
fora do quadrupolo. Obtem-se um espectro de massas variando-se gradualmente a
corrente e voltagem para detectar-se todos os ons presentes.
MS quadrupolo de transmisso:
consiste de um ionizador, lentes para
acelerar e focalizar os ons para a
entrada no quadrupolo, o quadrupolo
com controles de V e A, um detector
de ons. Todo o sistema necesssita
de alto vcuo.

Resoluo: separa ons com
diferenas de 0.3 m/z
A equao que governa a separao de ons por TOF :
m/z razo massa/carga do on
E potencial do pulso de extrao
s comprimento do setor em que E aplicado
d comprimento do tubo de vo
t tempo de vo do on




A energia cintica de um on
0.5mv
2
, assim ions mais leves
tm velocidade maior que os
pesados e atingem o detector
em menos tempo.
MS tempo de vo: ons so acelerados a partir do ionizador at um tubo de vo, sem campo
eltrico ou magntico, onde se movem na direo do detector com uma velocidade proporcional a
m/z. Ao contrrio de outros MS, no h limite superior de deteco de m/z. O TOF-MS afetado
pela energia inicial dos ons antes de serem acelerados. Para corrigir, utiliza-se um conjunto de
campos eltricos, o reflectron, que refocalizam os ons de mesma m/z com velocidades diferentes.
o mais preciso de todos os MS, permitindo anlise elementar. Podem fazer at 100 espectros
por segundo. Originalmente desenvolvido na dcada 1950, foi obscurecido pelos MS quadrupolos
at o desenvolvimento do MALDI nos anos 1980.
MS-TOF
Analisadores de massa
Espectrmetro de massa por tempo de vo
MS on-trap: formado por um quadrupolo tridimensional
Consiste de eletrodos cilndricos simtricos, que formam dois end caps e um anel. Pode ser
bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os eletrodos. A face interna de cada eletrodo
tem uma superfcie hiperblica. Uma corrente e voltagem so aplicadas ao eletrodo em forma de
anel, enquanto os end caps ficam aterrados.

De maneira anlogo ao MS quadrupolo linear, variando-se a voltagem ocorrem rpidas inverses
na direo do campo, com os ons sendo alternadamente acelerados e desacelerados na direo
axial e vice versa na direo radial, aprisionando-os. Aumentando-se a voltage, os ons assumem
trajetrias instveis e saem do trap, numa ordem de m/z crescente. Ainda que a resoluo do
MS ion trap seja mais baixa, apresenta como vantagem a pr-concentrao do on de interesse
antes da anlise.
Analisadores de massa
Ionizao por impacto de elctrons (EI)

As molculas so vaporizadas e bombardeadas
com eltrons de alta energia (70 eV), formando
de ons moleculares (+) quando esses eltrons
colidem com a molecula e deslocam elctrons
mais externas. Alguns desses ons so instveis
e de fragmentam em ons menores. Adequada
para compostos no termolbeis.
Dessorpo por Laser assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption)
(MALDI):

Tcnica desenvolvida por Karas e Hillkamp em 1988, para ionizao de
peptdeos e protenas, oligossacardeos, glicolipdeos, nucleotdeos, etc.
As amostras so co-cristalizadas com uma matriz (substncia que absorve luz
ultravioleta). Para protenas, utiliza-se o cido sinapnico, que absorve a radiao
de 337 nm do laser de nitrognio. A energia absorvida pela matriz transferida para
as molculas, evitando sua decomposio por calor. Aps a incidncia do pulso de
laser, uma grande quantidade de energia absorvida pela matriz e h uma
"exploso" com emisso de um gs com ons moleculares com uma carga.

Tcnicas de Ionizao
Mass Spectrometry
Matrix-assisted laser desorption ionizaton time of flight

Maldi-Tof

Tcnicas de Ionizao
Ionizao por electronspray (ESI)

Mtodo adequado para anlise de molculas termolbeis, como protenas.
O processo de ionizao das molculas ocorre pela nebulizao de gotculas
(nanolitros) de uma soluo em um campo eltrico intenso, formando gotculas
altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se ons moleculares de
simples ou mltiplas cargas. Podem ser formados ons (-) ou (+), de acordo com o
campo elctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos
(protonados) dos analitos e no modo negativo, os ons so desprotonados.
Tcnicas de Ionizao
Sequenciamento de novo de protenas por espectrometria de massas
Para sequenciar protenas
preciso obter o espectro
MS/MS de seus peptdeos.

Isso significa 2 etapas de
MS acopladas.
Depois de fazer o MS da
molcula inteira, esta
fragmentada dentro do
aparelho por coliso com
gases.
Os fragmentos so ento
separados e analisados por
MS.
hlio ou argnio
A ligao peptdica se quebra formando fragmentos tpicos, como os ons b e y
mostrados na figura acima, que tero massas diferentes de acordo com o radical
R de cada aminocido.
Quando um peptdeo analisado por MS/MS, a fragmentao gera uma famlia de
fragmentos peptdicos com massas que vo diferir uma da outra em valores que
correspondem a um on b, permitindo a identificao de cada aminocido.
Sequenciamento de novo de protenas
A sequncia obtida pela anlise dos ons de uma srie pode ser confirmada pela
determinao da sequncia feita a partir da srie complementar de ons, no caso do
exemplo, os ons y.
Sequenciamento de novo de protenas
Espectro MS/MS do peptdeo
trptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.


AA Codes Mono. AA Codes Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931


Analiza-se o espectro
buscando diferenas de
m/z equivalentes a um
resduo de aminocido,
que permitem conhecer
a seqncia do
peptdeos
perda de amnia = 17 u.m.
perda de H2O = 18 u.m.
perda de CO2= 28 u.m.
Sequenciamento de novo
Espectro MS/MS do peptdeo

GLSDGEWQQVLNVWGK.
ons b e a
ons y
http://prospector.ucsf.edu/
http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/index.html
http://www.ionsource.com/