ESQUEMA GENERAL

SESIN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plsmido

para que adquieran resistencia a un antibitico
SESIN 3: FUNCIN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN
Cortar el plsmido aislado con enzimas de restriccin y visualizarlo
en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio
SESIN 2: AISLAR el plsmido mediante la tcnica de
Lisis alcalina
OBJETIVO DE LA PRCTICA:
OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA
Medio LB + KANAMICINA
Escherichia coli
Se introducir el vector pET-TEM

Sitio mltiple de
restriccin
Origen de
replicacin
Gen que confiere
resistencia a kanamicina:
kanamicina
fosfotransferasa
PURIFICACIN PLSMIDOS

Niveles de impurezas aceptados por la FDA
Ccc: supercoiled circular covalently closed
Oc: open circular
Plsmidos
La diferencia en TAMAO entre el DNA
cromosomal y el DNA plasmdico permite
desarrrollar estrategias de purificacin
TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento
TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento
TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento
PURIFICACIN PLSMIDOS

Niveles de impurezas aceptados por la FDA
Ccc: supercoiled circular covalently closed
Oc: open circular
Purificacin de plsmidos
1. Lisis
Qumica
Mecnica
Cambios en la Tempratura
2. Remover partculas grandes
Centrifugacin
Filtracin (uso de membranas)
3. Purificacin intermedia
Precipitacin fraccionada
Adsorcin a membranas
4. Purificacin alta resolucin
Mtodos cromatogrficos:
Intercambio inico
Filtracin en gel
Afinidad
Disolver
Liofilizar
Formular
5. Conservar
ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE
PLSMIDOS POR LA TCNICA DE LISIS
ALCALINA
Aislamiento de plsmidos por el
mtodo de lisis alcalina
Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria
Solucin GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9
La glucosa no tiene carga pero es un osmolito
El EDTA une cationes divalentes como Mg
2+
y Ca
2+
en
la membrana celular, debilitando la membrana.
Tambin el Mg
2+
es cofactor de Dnasas
Componentes de la solucin GTE
Tris-HCl
Glucosa
Solucin de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%
Esta solucin disuelve los fosfolpidos y los
componentes protecos de las membranas celulares.
SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CLULAS
Solucin de
lisis
El NaOH
desnaturaliza el
DNA plasmdico y
cromosomal
Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con
protenas y lpidos.

El DNA cromosomal que se renaturaliza se atrapa en
el precipitado SDS/protenas/lpidos. Slo el DNA
plasmdico y molculas de RNA escapan del
precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL
SOBRENADANTE
El isopropanol precipita los cidos nuclecos
Incubar por 20 min a -20C
Lavar el botn con etanol al 70%: remueve sales y
remanentes de SDS. Tambin remueve el
isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se
evapora ms rpido
Purificacin de plsmidos
Por ejemplo unin al ptido 16mer
NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-
Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-
Gln-COOH
Cmo podramos monitorear el progreso de la purificacin
de plsmidos?
1. Absorbancia 260 nm
2. Electroforesis en geles de agarosa
Por la electroforesis en geles de agarosa se debe
monitorear la purificacin de plsmidos
DNA cromosomal
Plsmido abierto
Plsmido superenrrollado
1 Precipitacin con
isopropanol
2 Cromatografa
intercambo aninico
3 Filtracin con
membrana de
nitrocelulosa
4 Lo que se retuvo en
la membrana de
nitrocelulosa
Microscopia
de polmero de
agarosa
Uso de colorantes
Tincin con Syber Safe