REGULATION OF PURINERGIC

TRANSMISSION IN MESENTERIC ARTERIES

OF DEOXYCORTICOSTERONE ACETATE-SALT
HYPERTENSIVE RATS
INTRODUO
Presso arterial nervos
simpticos fornecem
circulao esplncnica
Alteraes circulao
esplncnica Aumento
presso arterial
Vasculatura esplncnica
nervos simpticos
liberam norepinefrina,
ATP e neuropeptdeo Y
(NPY)
Norepinefrina contrao
artrias (receptores
adrenrgicos -
1
ARs)





Receptores purinrgicos P2X
1
- canais de ctions
ativados por ATP
P2X
1
- despolarizao rpida e curta membrana musc.
liso (Potencial de juno excitatrio EJP)
Ativao canais Ca tipo L entrada Ca por P2X
1


Ectonucleotidases - ATP-ADP-AMP-Adenosina
Inibio liberao de ATP prejuncional adenosina nos
receptores de adenosina A
1
Inibio liberao de ATP norepinefrina ativao
2
ARs
INTRODUO
INTRODUO
Regulao liberao ATP e norepinefrina
nervos simpticos
Liberao nervos simpticos regulao
diferencial
2
ARs
Transmissores liberados pelos nervos
autonmicos controlados por diferentes
conjunto canais de Ca
Canais Ca tipo N predominantes terminais
nervosos simpticos (bloqueadores seletivos
em baixas frequncias de estimulao)


Canais de
clcio
voltagem-
dependente
Localizao Funo
Canais tipo L Msculo
esqueltico, no
msculo
cardaco, crebro
e retina
Bloqueio produz
relaxamento da
musculatura lisa
(vasos e outros
rgos) e efeito
sobre o msculo
cardaco
Canais tipo N, P,
Q e R
Terminais pr-
sinpticos
Liberao de
neurotransmissore
s
Canais
tipo T
Sistema nervoso,
msculos
cardaco e liso
vascular
Potenciais de ao
rtmicos das
clulas
musculares,
cardacas e
neurnios
BATISTA, 2009; PIMENTEL, 2003.
Artria mesentrica de rato,
ducto deferente da cobaia e
artria esplnica canina
norepinefrina e ATP so
igualmente inibidos por um
bloqueador do canal de Ca tipo
N
Liberao de ATP e NE pelos
nervos simpticos so
predominantemente controlada
pelos canais de Ca tipo N
Ratos hipertensos DOCA-SAL
transmisso purinrgica
prejudicada e a liberao de
noradrenalina mantida
Afeta diferencialmente ATP e o
armazenamento de
noradrenalina ou seus
mecanismos de liberao

INTRODUO
INTRODUO
Hiptese - liberao noradrenalina e ATP so regulados
diferencialmente por canais de clcio, prejudicado na
hipertenso DOCA-sal
Medir EJP e norepinefrina - amperometria e mtodos
eletrofisiolgicos intracelulares
Antagonistas dos canais de Ca - avaliar a contribuio
dos canais de Ca tipo N e P/Q de canais de clcio para
a norepinefrina e liberao de ATP
Perturbao da regulao prejuncional de norepinefrina e
liberao de ATP causado pelo stress oxidativo
Apocinina - reduzir o estresse oxidativo e restaurar a
regulao prejuncional de norepinefrina e liberao de
ATP


PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Animais
Ratos Sprague-Dawley
Charles River Laboratories (Portage, MI)
Institutional Animal Care and Use Committee at
Michigan State University
Alojados em salas de temperatura e umidade
controladas com ciclo 12:12 h de luz-escurido


PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Hipertenso DOCA-sal





Sham foram operados e submetidos
somente a remoo do rim esquerdo


Rim esquerdo foi
removido aps a
ligadura da artria
renal, veia e ureter
Implantao DOCA
(600 mg/kg s.c.)
acetato de
desoxicorticosterona
Leito aquecido
Enrofloxacina, 5
mg/kg s.c.
Butorfanol tartarato,
2 mg/kg, s.c.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Ratos implantados DOCA
rao padro e gua
salgada (1% NaCl + 0,2%
KCl) ad libitum
Ratos sham rao
padro e gua da
torneira ad libitum
A presso arterial
sistlica foi medida
utilizando o mtodo de
cauda-manguito 4
semanas aps a cirurgia
Presso sangunea
sistlica 150 mmHg
foram considerados
hipertensos
10 ratos DOCA-sal
receberam apocinina (2
mM) na gua durante as
quatro semanas antes da
coleta dos tecidos
para estudos in vitro
PREPARAO DE TECIDOS
4 semanas aps a cirurgia
Ratos anestesiados com pentobarbital sdico (50 mg/kg
i.p.)
Sacrificados por pneumotrax e corte da aorta
abdominal
O mesentrio removido, dissecado, limpo de tecido
conjuntivo e adiposo e fixado utilizando os pinos de ao
inoxidvel (50 mm de dimetro) numa cmara de
perfuso revestido com Sylgard (Dow Corning,
Midland, MI).
Os tecidos superfundidos com soluo de Krebs.
Nifedipina (1 uM) (antagonista do canal de clcio de tipo L )
Prazosina (0,1 mM) (antagonista do AR)
Adicionados para atenuar a constrio dos vasos durante a
estimulao eltrica do nervo
Anlises aps 30 minutos
Registros das clulas
musculares lisas arteriais
foram obtidos
individualmente utilizando
microeletrodos de vidro
cheios de 2M KCl (100-200
M resistncia de ponta)
Os registros foram aceitos se
os seguintes critrios fossem
atendidos: (1) penetrao
celular abrupta (2) potencial
de membrana -50 mV (3)
potencial de membrana
estvel por pelo menos 5
minutos
Registro de cada nica
clula durou 20-120
minutos
Um amplificador Dagan
Instruments Um IX2-700
(Minneapolis, MN) foi
utilizado para registar o
potencial de membrana
EJPs foram induzidos
usando soluo Krebs,
bipolar, eletrodo
estimulante focal contendo
dois eletrodos paralelos
de fio de Ag/AgCl
conectados a um
estimulador Grass
Instruments S88 (Grass
Technologies, Astro-Med,
Inc., West Warwick, RI)
Nervos periarteriais foram
estimulados na mais baixa
tenso (50-120), o que
produziu um EJP amplitude
mxima
Pulsos curtos (5 pulsos de
0,5 Hz, durao de pulso de
0,5 ms) foram utilizados
para estudar a facilitao
EJP
Os sinais foram
amostrados a 5 kHz e
filtrado a 500 Hz usando
um conversor analgico-
digital (Digidata 1200, Axon
Instruments / Molecular
Devices, Sunnyvale, CA) e
software Axoscope 9.0
(Axon Instruments /
Molecular Devices)
Uma mdia digital de cinco
valores foi utilizada para
medir a amplitude do EJPs
em condies de controle e
de tratamento
Os dados foram
analisados usando
software Clampfit 9,0 s
Registros eletrofisiolgicos de EJPs

MEDIO AMPEROMETRIA



Microeletrodos de fibra de carbono foram embebidos em lcool isoproplico
(IPA) e afixados a um micromanipulador (MP-1, Narishige Instruments, Japo)
Um fio de platina (KCl 3M, modelo EE009, Cypress Systems Inc., EUA) e
eletrodos de referncia foram tambm montados no banho para completar a
clula eletroqumica

Medies eletroqumicas foram realizadas com um potenciostato analgico
Omni 90 (Cypress Systems Inc.), um conversor analgico digital (Digidata 1200)
e software Axoscope 9,0

Curvas amperomtricas contnuas i - t foram registradas em um potencial de
deteco de 400 mV

Liberao de noradrenalina foi induzida usando a estimulao do nervo (10 Hz,
3s 60-80V) e um eletrodo bipolar estimulante focal
A tenso de sada analgica do potenciostato foi filtrada com uma constante de
tempo de 200 ms (5 Hz), antes de serem digitalizados utilizando um conversor
A/D a uma taxa de amostragem de 100 Hz
Os dados foram armazenados num computador para processamento posterior

DIHYDROETHIDIUM (DHE) COLORAO

Gnglios mesentrica
inferior (IMG) foram
removidos e
armazenados em
soluo gelada de
Krebs-Ringer-HEPES
(KRH)
Tecidos dissecados
foram colocados
temperatura ambiente
antes da incubao
com soluo 2 mM DHE
em um tubo de luz
protegida a 37C por 60
min
Aps incubao com
DHE, foram lavadas 3x
com soluo KRH e
montado com
Fluoromount G
(Southern
Biotechnology
Associates)
Imagens fluorescentes
confocal foram obtidas
(543 nm de excitao;
comprimentos de onda>
560 foram recolhidos;
Zeiss, LSM 5 Pascal)
Gnglios de ratos no
tratados e tratados com
apocinina foram
processados e
fotografados em
condies idnticas
Os neurnios foram
contados e a
intensidade de
fluorescncia de cada
amostra foi medida
usando offline Image-
Pro Plus 2
Aplicao de Drogas
Drogas foram adicionados ao tampo fisiolgico ou
aplicadas diretamente no local pelo sistema de
aplicao de drogas local (VC-8 Controlador de
Vlvula, Warner Instruments, Hamden, CT)
Os medicamentos foram aplicados por um perodo
mnimo de 5 minutos antes de testar os efeitos de
drogas.
Quando as toxinas dos canais de clcio foram
aplicadas em concentrao ascendente, cada
concentrao foi deixada equilibrar durante 5 minutos
antes do teste da EJP ou da amplitude da corrente
de oxidao NE

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Estatstica
Os dados so apresentados como mdia
EPM
Dados de concentrao-resposta foram
ajustadas por meio de regresso no-linear e a
equao de Hill (Graphpad Prism, San Diego,
EUA)
Os dados foram analisados pelo teste t de
Student ou ANOVA de uma via com Newman-
Keuls post-hoc, conforme apropriado. As
diferenas foram consideradas significativas
quando P <0,05

CANAIS DE CLCIO
RESULTADOS
VRIOS CANAIS DE CLCIO CONTRIBUEM PARA A LIBERAO DE
NORADRENALINA DOS NERVOS SIMPTICOS PERIARTERIAIS.
CdCl2 e CTX inibem as correntes de oxidao de NE registradas
na artria mesentrica.
(A) Correntes de oxidao NE so bloqueados por CdCl2.

(B) Inibio dependente da concentrao
das correntes de oxidao da NE em artrias
de sham e DOCA-sal.
CdCl2 inibiu completamente a corrente, mas
a curva dos ratos DOCA-sal foi deslocada
para a direita comparada a artria
mesentrica dos sham.
RESULTADOS
(C) Curva concentrao- resposta da
inibio de CTX da corrente de
oxidao da NE em artrias
mesentricas de sham e DOCA-sal.
Os modelos foram igualmente
sensveis a CTX, que inibiu as
correntes de oxidao por um mximo
de 60%.

o (D) ATX inibe correntes de oxidao NE
em artrias mesentricas de sham,
mas no de DOCA-sal.
DISCUSSO
Mltiplos subtipos de canais de clcio contribuem para a
transmisso do nervo simptico na artria mesentrica e a
liberao de NE e ATP nos nervos simpticos pode ser
diferentemente regulada. (Tanaka et al., 1999)
NE e ATP podem ser armazenados e liberados em diferentes
terminaes nervosas ou em populaes separadas vesculas
de dentro do mesmo nervo terminal. (Dunn et al., 1999;
Conceicao et al., 2005; Smyth et al., 2009)
NE e ATP so co-liberados das mesmas terminaes
nervosas e possivelmente das mesmas vesculas.(Brain,
2009)

ATP e NE podem ser armazenados e liberados
diferentemente.
Podem haver mltiplos pools de NE que tambm so
diferentemente regulados por canais de clcio do tipo N e
P/Q.


DISCUSSO
CTX inibiu as correntes de oxidao da NE igualmente em
artrias de sham e DOCA-sal, o que indica que a funo dos
canais de clcio do tipo N no est alterada no modelo de
hipertenso DOCA-sal.
CTX produziu uma inibio mxima entre 50-60%, o que
sugere que outros canais de clcio contribuem para a
liberao de NE nos nervos simpticos periarteriais.

ATX inibe as correntes de oxidao de NE em 25-30%
sugerindo que canais de clcio do tipo P/Q contribuem para a
resistncia do CTX a liberao da NE.
Em contraste aos canais de clcio do tipo N, a expresso/
funo dos canais P/Q reduzida no modelo DOCA-sal de
hipertenso, bem como ATX no alterou as correntes de
oxidao de NE nas artrias mesentricas do modelo DOCA-
sal.

DISCUSSO
ATX no modificou a amplitude de EJPs evocados por um
nico estmulo em artrias mesentricas de ratos.
No existe co-armazenamento completo de norepinefrina e
ATP em nervos simpticos que abastecem artrias
mesentricas de rato.
H um conjunto de co-armazenado de norepinefrina / ATP
acoplado aos canais de clcio tipo N.
H um conjunto separado de vesculas que contm
norepinefrina, que acoplado seletivamente aos canais de
clcio tipo P/Q.
A hipertenso DOCA-sal est associada com o
armazenamento e / ou liberao deficiente de ATP nos nervos
simpticos periarteriais.

RESULTADOS
CTX INIBE EJPS EM ARTRIAS MESENTRICAS DE
SHAM E RATOS DOCA-SAL

(A) os registros representativos de EJPs de artrias
mesentricas de sham na ausncia e na presena de
CTX. EJPs foram evocados por pulsos de cinco estmulos
(nas setas) em 0,5 Hz. CTX inibiu as EJPs.
RESULTADOS
As curvas de resposta de concentrao
(C) CTX para inibio EJP so as
mesmas nas artrias sham e DOCA-sal.
(B) CTX inibe o primeiro e o quinto EJP
em um pulso de estimulao. EJPs
registradas de artrias DOCA-sal foram
menores do que nas artrias EJPs sham.
RESULTADOS
ATX AUMENTA A FACILITAO DO POTENCIAL DE
JUNO EXCITATRIO.
ATX aumenta EJPs em artrias sham mas no em artrias
DOCA-sal.
(A) Registos representativos do primeiro e quinto EJPs
evocados por um pulso de estmulo de 0,5 Hz na ausncia e
na presena de ATX (10 nM). ATX aumentou o quinto, mas
no o primeiro EJP.
RESULTADOS
(B) Pool de dados de estudos
semelhantes aos mostrados em (A)- ATX
aumentou o quinto EJP no pulso em
artrias de sham, mas no em DOCA-
sal.
C) As curvas de concentrao-resposta
para facilitao induzida por ATX do
quinto EJP em artrias sham, mas no
em DOCA-sal .

RESULTADOS
CANAIS DE CLCIO DO TIPO P/Q LIGAM 2ARS A
INIBIO DA LIBERAO DE ATP
ATX e ioimbina aumentam a amplitude EJP atravs de um
mecanismo comum em artrias mesentricas sham.
(A) Registos representativos da primeira e quinta EJPs
evocados por um pulso de cinco de estmulos a 0,5 Hz. O
primeiro EJP permaneceu inalterado por uma ou outra
droga. O quinto EJP sofreu aumento em amplitude por
ioimbina (1 M) e ATX (0,03 M).
RESULTADOS
(B) A ioimbina e ATX aumentaram a amplitude da quinta EJP.
A resposta causada pela aplicao combinada de ambas as
drogas no foi diferente do que o causado por qualquer um
dos frmacos sozinhos.
O ATX sensvel a liberao de norepinefrina pode ser
responsvel pela ativao prejunctional de receptores
2
adrenrgicos que levam a autoinibio de liberao de
ATP. Esta concluso baseia-se nos dados que demonstram
que o antagonista dos receptores
2
adrenrgicos ,
ioimbina, no alterou EJP no primeiro pulso do estmulo, o
potencializou no quinto.
Aplicao combinada de ATX e ioimbina no produziu um
aumento aditivo em amplitude do EJP, sugerindo que essas
drogas agiram atravs de um mecanismo comum.
NE atua nos receptores
2
adrenrgicos prejunctionais para
modular a liberao de NE e ATP nos nervos simpticos
( Stjrne e Stjrne de 1995 ).
DISCUSSO
O primeiro EJP num pulso de estmulo no alterado por
antagonistas da
2
AR porque no h norepinefrina presente
na juno neuroefetora para ativar os receptores
adrenrgicos
2
( Dunn et al., 1999 ).
Mltiplos estmulos podem ocasionar acmulo de NE
prximo juno neuroefetora e sob essas condies
2
ARs
so ativados e inibem a liberao de NE e ATP.

O primeiro potencial no foi alterado pela Ioimbina, mas o
quinto sofreu aumento.
Uma ao potencial dependente da liberao do pool de
norepinefrina responsvel por ativar
2
ARs controlada
seletivamente por canais do tipo P / Q clcio.
DISCUSSO
1) A liberao de ATP e noradrenalina no nervo simptico
perivascular diferentemente regulada por canais de clcio do
tipo N e P/Q.
ATP- canais de clcio do tipo N
NE- canais de clcio do tipo N e P/Q

2) Canais de clcio P/Q- regulao seletiva da liberao de uma
quantidade de NE que ativa os receptores 2 adrenrgicos, e
este mecanismo defeituoso no modelo de hipertenso DOCA-
sal.
RESULTADOS
Hipertenso DOCA-sal no altera a sensibilidade ao clcio
da transmisso purinrgica
O aumento excessivo de noradrenalina devido, em parte,
reduo da funo do receptor adrenrgico -2 pr-juncional na
hipertenso DOCA-sal.

O resultado apresentado indica que um mecanismo adicional pode
contribuir para a funo prejudicada dos receptores adrenrgicos -2
na hipertenso DOCA-sal

Em ratos normotensos, os canais de clcio do tipo P/Q se acoplam
para a liberao de um pool de vesculas contendo noradrenalina,
que por sua vez ativa os receptores adrenrgicos -2 para inibir a
liberao de noradrenalina e ATP.

Isso explicaria a reduo da funo dos os receptores adrenrgicos
-2 em nervos simpticos que suprem a artria mesentrica de ratos
DOCA-sal.



DISCUSSO
A perda da funo dos receptores adrenrgicos -2 deve ser
associada com uma aumento na amplitude de EJP e da liberao
de ATP. Este paradoxo pode ser explicado pela diminuio da
disponibilidade de ATP na terminao nervosa e reduo da
amplitude do EJP nas artrias mesentricas de ratos DOCA-sal.

Outro ponto a considerar quando se fala de diferentes mecanismos
de controle de liberao de noradrenalina e ATP so os diferentes
parmetros de estimulao que foram usados.

Os diferentes parmetros de estimulao podem recrutar diferentes
conjuntos de canais de clcio de terminais nervosos e alterar a
sensibilidade ao ATP ou a liberao de noradrenalina ao bloqueio
por diferentes antagonistas dos canais.









DISCUSSO
RESULTADOS
Apocinina restaura a regulao do receptor 2-adrenrgico de
liberao de ATP dos nervos simpticos de ratos DOCA-sal
Apocinina restaura regulao do receptor 2-adrenrgico de liberao
de noradrenalina dos nervos simpticos de ratos DOCA-sal
RESULTADOS
RESULTADOS
Tratamento com apocinina reduziu o nvel de O2 em gnglios
simpticos.
O estresse oxidativo, principalmente aumento de O2 em nervos
simpticos e artria mesentrica, pode ser responsvel pelo
rompimento dos mecanismos ligados regulao pr-juncional dos
receptores adrenrgicos -2 de liberao de ATP a partir de nervos
simpticos na hipertenso DOCA-sal.

A apocinina uma droga antioxidante que pode atuar como inibidor da
NADPH-oxidase e de outras enzimas geradoras de O2.

O tratamento com apocinina reduziu os nveis de O2 em gnglios
simpticos, como foi mostrado pela reduo da fluorescncia induzida
por DHE. Isto foi associado com uma melhora na regulao do receptor
-2 adrenrgico pr-juncional de liberao do ATP




DISCUSSO
CONCLUSO
Os dados indicam que os canais de clcio tipo N e P/Q se
juntam liberao de noradrenalina de nervos simpticos
que suprem as artrias mesentricas de ratos.

Somente os canais de clcio tipo N se juntam liberao de
ATP.

O pool de noradrenalina acoplado a canais de clcio do tipo
P/Q est associado a regulao receptor 2-adrenrgicos da
liberao de ATP nos nervos simpticos periarteriais.

Os dados indicam que pode haver armazenamento separado
de noradrenalina e ATP nas terminaes nervosas simpticas
e esses abastecimentos so acoplados diferentemente aos
subtipos de canais de clcio das terminaes nervosas.

A hipertenso DOCA-sal est associada a uma perda da funo do
canal de clcio P/Q, mas no do tipo N, e a uma interrupo na
regulao da liberao de ATP mediada por receptores -2
adrenrgicos.

A interrupo da funo dos receptores -2 adrenrgicos causada
pelo estresse oxidativo, provavelmente pelo aumento de O2 em ou
perto de terminaes nervosas simpticas na parede arterial

Estes estudos destacam a complexa regulao de transmissores
vasoconstritores de nervos simpticos periarteriais.

Estes estudos indicam que os canais de clcio do tipo P/Q e
receptores -2 adrenrgicos so alvos moleculares para as
alteraes fisiopatolgicas da funo do nervo simptico, conhecida
a ocorrncia de hipertenso sensvel ao sal.

CONCLUSO
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
DEMEL, S. L. et al. Regulation Of Purinergic Transmission In Mesenteric
Arteries Of Deoxycorticosterone Acetate-salt Hypertensive Rats.
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2010.

CASTRO JUNIOR, Clio Jos de. EFEITO DA TOXINA PhTx3-4 DO
VENENO de Phoneutria nigriventer NA CONCENTRAO
INTRACELULAR Ca2+ E NA EXOCITOSE EM
SINAPTOSOMAS. 2007. 68 f. Dissertao (Mestrado) - Curso de Ps
Graduao em Farmacologia Bioqumica e Molecular, Departamento de
Farmacologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,
2007.