Neurognese Hipocampal Regula o esquecimento

durante a idade adulta e na Infncia

Karine M. C. Dallagnol
Introduo
Nas redes cerebrais h uma troca entre a plasticidade, a capacidade de incorporar
novas informaes, estabilidade e assegurar que o processo de incorporao de novas
informaes no degrade a informao j armazenada nessa rede.
Hipocampo
Giro Denteado
Zona Subgranular
Novos Neurnios
Aprendizagem
Como novos neurnios integram no hipocampo, eles competem com as clulas existentes
para inputs e outputs, estabelecendo novas conexes sinpticas que podem coexistir com,
ou mesmo substituir, conexes sinpticas j existentes;

Essa remodelao altera necessariamente a configurao de circuitos DG- CA3 e
provavelmente vo levar ao esquecimento de informaes j armazenadas nos circuitos;

Esse esquecimento induzido mais pronunciado na infncia, quando a neurognese
alta, sendo diminuido drsticamente com a idade.

A maturao cerebral contnua pode interferir com a consolidao e/ou armazenamento
de memrias infantis, tornando-os inacessveis em momentos posteriores, sendo
chamada de amnsia infantil.
Memria de longo prazo:


As regies do hipocampo responsveis pela consolidao da memria so chamadas de
cornos de Amon regies CA, subdivididas em subregies denominadas: CA1, CA2, CA3,
CA4.

Regies envolvidas com a consolidao da memria: hipocampo (CA1 e CA3
principalmente), crtex entorrinal, crtex perirrinal e giro para-hipocampal. Sendo que as
leses no crtex perirrinal como em CA1 e CA3, levam dficits agudo de memria.

A -endorfina parece ser a substncia ligada ao esquecimento.
Objetivo
Testar se a neurognese ps-natal, em particular, modula as
mudanas ontogenticas na persistncia da memria.
Materiais e Mtodos
Animais: Camundongos machos e fmeas, 21 dias de idade, do tipo selvagem (WT) hibridos F1;
e geneticamente modificados:
1) Lacz reprter cruzado com Nestina-CRE ERT2 ou com Rosa-Lacz. Foi administrado
Tamoxifeno (TAM) para expressar Lacz apenas em clulas Nestina+ e sua descendencia;
2) Camundongos TK: a modificao do gene HSV - 1 timidina -quinase ( TK ) expresso sob o
controle de um promotor de nestina. Nesses caundongos a administrao de ganciclovir (GAN)
causa terminao prematura da cadeia de DNA e apoptose de apenas clulas nestin +.
3) os camundongos iKO-p53 foram cruzados com a linhagem floxed-p53 e nestin - CreERT2.
Nesses camundongos, a administrao de TAM leva excluso de p53 apenas em clulas
nestin+.

Dia de nascimento foi designado P0 .

Guinea pigs: Hartley Guineas Pig.
Octodon Degus. Chinchila.


Nestina uma protena expressa principalmente em clulas gliais ou
neurais indiferenciadas durante o desenvolvimento.


Tratamentos
Retrovrus . Os novos neurnios foram marcados com um vetor retroviral deficiente em
replicao, no qual um promotor CAG impulsiona a expresso da protena verde fluorescente
(GFP ).
Foi infundido o retrovirus no Giro Denteado (DG).

Roda de corrida voluntria (VWR): Um grupo com roda livre, um grupo de roda travada e um
grupo sem roda (controle sedentrio).

BrdU . (5-bromo-2-deoxyuridine): Usado para identificar apoptose celular e marcador de
proliferao celular.

Ganciclovir. Antiviral. GAN foi misturado no alimento em p e dado aos camundongos ad
libitum.

Tamoxifeno (TAM): Modulador Seletivo do Receptor de Estrgeno.

Memantina (MEM): Usada no tratamento de Alzheimer, impedindo que o excesso de
glutamato atue sobre a molcula receptora de glutamato do neurnio adjacente, evitando a
entrada excessiva de clcio, que levaria morte neuronal.
Fluoxetina (FLX) ou placebo: antidepressivo, inibidor selectivo da recaptao da serotonina.

Temozolomida (TMZ): Usado no tratamento de cncer, atua no DNA da clula cancergena
alterando ou evitando a duplicao celular, interferindo assim no crescimento do tumor.

P7C3: Usado no tratamento de Alzheimer, possui efeitos neuroprotetor e neurognico.


Tratamentos
Teste Comportamental
Condicionamento do Medo Contextual: Trata-se de tomar um animal e coloc-o em um
ambiente novo, proporcionando um estmulo aversivo (choque), e, em seguida, remov-lo.
Quando o animal devolvido para o mesmo ambiente, ele geralmente vai demonstrar uma
resposta de congelamento ao se lembrar e associar do ambiente com o estmulo aversivo.

Congelamento: Foi medido utilizando um software .

Paradima de Aprendizagem Incidental Contextual: Os camundongos foram previamente
habituados s cmaras por 10 min. E receberam um nico choque.

Labirinto Aqutico de Morris .



Teste Comportamental
Teste Labirinto de Barnes : Teste usado para mensurar aprendizado espacial e memria; usa-
se de pistas visuais para encontrar uma toca.

Condicionamento de averso ao sabor . Os caundongos tiveram restrio gradual de gua, at
receber o minimo necessario para manter a 90% do peso corporal inicial; as garrafas de gua
foram substitudas por um nico frasco contendo um soluo de sacarina.
Procedimentos experimentais
especficos
As diferenas de idade na neurognese em camundongos: Foi infundido no DG retrovrus
expressando GFP (green fluorescent protein) em P17 ou P60 .

As diferenas de idade na remodelao sinptica em camundongos. Foi desenvolvido um
modelo computacional para estimar diferenas entre camundongos de P17 e P60 da
quantidade de remodelao sinptica DG - CA3 que ocorre ao longo do tempo .

As diferenas de idade na persistncia da memria em camundongos: Grupos separados de
P17 ou P60 foram treinados em Medo Contextual Condicionado e testados 1, 7, 14 , ou 28 dias
depois.
Outros grupos de controle P17 ou P60 no receberam choques nos ps.
Foi medindo a distncia percorrida, imediatamente antes e durante os choques nos ps .

Efeito da TAM na aquisio de memria do medo contextual: Avaliou se o tratamento TAM
tem efeitos agudos sobre o comportamento e neurognese, treinando no Medo Condicionado
Contextual e testado 24 horas aps TAM.

Procedimentos experimentais
especficos
Efeito da corrida sobre a neurognese hipocampal adulta em camundongos adultos: Para
avaliar se corrida voluntria aumenta a neurognese.

Grupos separados de camundongos permaneceram sedentrios ou tiveram acesso a uma
roda de corrida para 0, 3, 7, 14, ou 28 dias a partir de P60 .

Controle da presena de um objeto novo na gaiola;
Injetados com BrdU;
Administrao de retrovrus expressando GFP infundida no DG.
Camundongos LacZ/Rosa foram injetados com a TAM.


Efeito da corrida sobre a memria de medo contextual e bloqueio do efeito da corrida pela
supresso gentica na neurogenese em camundongos adultos: Camundongos reprter LacZ
foram injetados com a TAM e submetidos ao teste de Medo Contextual Condicionado,
Camundongos TK+ e WT receberam GAN e foram treinados no Medo Condicionado
Contextual.
Efeito do aumento farmacolgico na neurognese sobre a memria de medo contextual e
bloqueio por supresso gentica em camundongos adultos: Foram submetidos ao
Condicionamento de Medo Contextual.
Grupos separados receberam as doses de MEM ou veculo em frequncias diferentes.
Usou-se FLX ou placebo para o Teste Labirinto de Barnes

Efeito do aumento gentico na neurognese sobre a memoria contextual do medo em
camundongos adultos: Camundongos iKO-p53 e WT testados por Medo Condicionado
Contextual e tratados com TAM.

Efeito da corrida sobre outras memrias dependentes do hipocampo em camundongos
adultos: Foram usados os teste de Aprendizagem Contextual Paradigma Incidental e Labirinto
Aqutico de Morris.

Efeito da corrida sobre a memoria independente do hipocampo em camundongos adultos:
Foram treinados na averso ao sabor condicionado.
Procedimentos experimentais
especficos
Efeito de reduo gentica da neurognese sobre a memria em camundongos infantis .
Camundongos TK + e WT foram administrados com GAN e foram treinados no Medo
Condicionado Contextual.

Efeito da reduo farmacolgica na neurognese sobre a memria em camundongos infantis:
Foram treinados no Paradigma de Aprendizagem Incidental Contextual; receberam veculo ou
TMZ ou P7C3

A falta de diferenas de idade na neurognese e persistncia da memria em Guineas Pig e
Degus: Sofreram o teste de Medo Condicionado Contextual e o Labirinto Aquatico de Morris.

Efeito da corrida e farmacolgico no aumento da neurogenese sobre a persistncia da
memria em degus e porquinhos da ndia infantis: Foram treinados no Medo Condicionado
Contextual, depois permaneceram sedentrios, correram, ou receberam veculo ou MEM.
E foram treinados para localizar a plataforma escondida no labirinto de gua, e receberam
veculo ou MEM.
Procedimentos experimentais
especficos
Resultados
Nveis dependentes da idade na neurognese hipocampal e estabilidade da
memria so inversamente proporcionais em camundongos.
A) A marcao GFP de clulas
granulares no DG e CA3 1 ms
aps a infeco retroviral mostra
que camundongos infantis (P17)
tiveram nveis mais altos de
neurognese do que adultos
(P60).
B) Os infantis tinham mais
clulas DCX+ no DG e CA3 do
que adultos.
Fig. 1. Age-dependent levels of hippocampal neurogenesis and memory stability are inversely related in mice. (A) GFP labeling of granule cells in the DG and CA3 1 month
after retroviral infection shows that infant (P17) mice had higher levels of neurogenesis than adult (P60) mice. (Left) Low magnification of DG and CA3 regions. Scale bar, 200
mm. (Right) High magnification of CA3 region showing GFP+ mossy fibers and LMTs. Scale bar, 50 mm. (B) Top row: Infants had more DCX+ cells in the DG and CA3 than
adults. Scale bar, 100 mm. Bottom row: High magnification of DG and CA3. Scale bar, 50 mm. (C to F) Infants showed more (C) GFP+ neurons (t6 = 8.57, P < 0.001), (D)
proliferating (Ki67+) cells (t7 = 4.53, P < 0.01), and (E) immature (DCX+) neurons in theDG (t6 = 18.65, P<0.001), as well as more (F) DCX+ LMTs in the CA3 (t6 = 15.03, P <
0.001) than adults (n = 4 to 5 per group). (G) Separate groups of infant and adult mice were trained in contextual fear conditioning and tested 1, 7, 14, or 28 days later (n = 8
to 9 per group). (H) Context fear memory persisted for at least 28 days in adult mice, whereas infants showed intact memory shortly after training but forgetting after longer
delays (age day, F3,62 = 13.07, P < 0.001; post-hoc t tests, 1 day, P < 0.05; 7 days, P < 0.001; 14 days, P < 0.001; 28 days, P < 0.001). (I) Infants and adults showed equivalent
shock reactivity during training (P17 n = 9, P60 n = 8; arbitrary units, P > 0.05). (J) Inverse relationship between neurogenesis and memory persistence predicts that increasing
neurogenesis in adults will induce forgetting, whereas decreasing neurogenesis in infants will mitigate forgetting. In all panels, cells/LMTs are expressed as number of
cells/LMTs per 1000 mm2. *P < 0.05. For all figures, error bars represent standard error of the mean (SEM). DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole.
C) Infantis mostram mais neurnios GFP+ ; (D) proliferao de clulas Ki67+;
E (E) neurnios imaturos DCX+ no DG; e F) mais LMTs DCX+ no CA3 que em adultos.
Ki-67 uma protena presente em todas as fases do ciclo de diviso celular
(H) Memria de medo Contextual persistiu por pelo menos 28 dias em camundongos adultos,
os infantis mostraram memria intacta logo aps o treino, mas esquecendo no decorrer dos
dias.

(I) Infantis e adultos mostraram equivalente reao ao choque durante o treino.

(J) Relao inversa entre neurognese e persistncia da memria prediz que aumentar a
neurognese em adultos induz esquecimento, e diminuindo a neurognese em crianas
atenua o esquecimento.
Corrida voluntria aumena a neurognese e promove o
esquecimento em camundongos adultos
(A) Adultos (P60) que tiveram acesso
VRW por 28 dias apresentaram mais
neurnios imaturos (DCX+) no DG e
LMTs no CA3 que sedentrios.

(B a D) Os adultos aumentaram a
proliferao de clulas Ki67+ e neurnios
imaturos (DCX+) no DG e mais LMTs no CA3
comparado com sedentrios.
Fig. 2. Voluntary running increases neurogenesis and promotes forgetting in adult mice. (A) Adult (P60) mice given access to a running wheel for 28 days
showed more immature (DCX+) neurons in the DG and LMTs in the CA3 than sedentary mice. Scale bar, 50 mm. (B to D) Adult mice were given access to a
running wheel for 0, 3, 7, 14, or 28 days. Running increased the number of (B) proliferating (Ki67+) cells (n = 8 per group; running day, F4,70 = 7.71, P <
0.001; post hoc t tests, 7 days, P < 0.001; 14 days, P < 0.001; 28 days, P = 0.001), and (C) immature (DCX+) neurons in the DG (n = 4 to 8 per group; running
day, F4,34=3.17, P <0.05; 7 days, P < 0.05; 14 days, P<0.001; 28days, P < 0.05), as well as more (D) DCX+ LMTs in the CA3 (n = 4 per group; runningday,
F4,30 = 3.45, P < 0.05; 7 days, P = 0.001; 14 days, P < 0.05; 28 days, P < 0.05) compared with sedentary controls.
(E) Neurognese remodela circito DG-CA3;

(F) Adultos correram ou permaneceram
sedentrios aps Condicionamento do medo
contextual;

(G e H) Correr aumentou a neurognese e
induziu esquecimento;

(I) Adultos correram ou no, antes do medo
condicionado;

(J e K) Correr aumentou a neurognese mas
no afetou a formao da memria de medo
contextual.
(E) Neurogenesis remodels DG-CA3 circuits. Retrovirus-labeled presynaptic LMTs from new neurons (GFP+) in close apposition to existing presynaptic LMTs
from mature neurons (ZnT3+). Scale bar, 50 mm. Confocal stacks used to reconstruct representative three-dimensional images of new LMTs (green) in close
contact with existing LMTs (red) in the CA3. (F) Adult mice ran or remained sedentary after contextual fear conditioning. (G and H) Running increased
neurogenesis (sedentary n = 8, running n=8; LacZ+ cells; t14=2.81, P < 0.05) and induced forgetting (sedentary n = 9, running n = 8; t15 = 2.75, P < 0.05). (I)
Adult mice ran or remained sedentary before contextual fear conditioning. (J and K) Running increased neurogenesis (sedentary n = 7, running n = 8; t13 =
2.96, P < 0.05) but did not affect formation of a context fear memory (sedentary n = 10, running n = 9; P > 0.05). In all panels, cells/LMTs are expressed as
number of cells/LMTs per 1000 mm2. *P < 0.05.
Esquecimento depende do aumentou da neurognese
(A) Adultos tratados com GAN: WT e TK+
correram ou no, ou correram aps o
condicionamento de medo.

(B) Correr aumentou a neurognese e (C) induziu
o esquecimento da memria de medo
contextual em WT.

(D) Adultos WT tratados com MEM aps
condicionamento de medo mostrou (E) aumento
da neurognese e (F) Esqueceram a memria de
medo contextual comparado ao tratado com
veculo.
(G) Adultos tratados com GAN: WT e TK+ foram
tratados com veculo ou MEM aps
condicionamento de medo.

MEM (H) aumentou a neurognese e (I) induziu
esquecimento da memria de medo em WT ;

(J) Tratamento com tamoxifeno em ps-treino
(K) Aumentou a neurognese e (L) Induziu
esquecimento da memria de medo em iKO-p53
em relao aos WT.
(A) Infantis tratados com GAN: WT ou TK+ foram
treinados no medo condicionado ou sem choque.

(B) TK+ tiveram menos proliferao de clulas Ki67+
e (C) neurnios imaturos (DCX+)no DG que WT.

(D) WT e TK+ chocados, mostraram equivalente
memria de medo 1 dia aps o treino.

(E) WT chocados apresentaram esquecimento da
memria de medo ap 7 dias do treino.

(F) Relao inversa entre proliferao e persistncia
da memria entre os camundongos chocados 7 dias
aps o treino.
Diminuio gentica e farmacolgica na neurognese atenuando o
esquecimento em camundongos infantis
(G) Infantis tratados com veculo ou TMZ , aps
treinados no Paradigma de aprendizagem
incidental contextual.

(H) Tratados com TMZ tiveram baixa
proliferao de clulas Ki67+ e (I) neurnios
imaturos (DCX+) no DG.

( J) Os chocados tratados com TMZ mostraram
menos esquecimento da memria contextual.

(K) Relao inversa entre proliferao e
persistncia da memria entre os
camundongos chocados.

(A) Clulas DCX+ no DG de
Degus infantis e adultos.

(B) Clulas DCX+ no DG em
Guineas Pig de infantis e
adultos.
Guineas Pig e Degus mostram baixa neurognese ps-natal e
memrias infantis persistentes
Mostra reduzida queda relacionada idade em (C)
proliferao de clulas Ki67+ e (D) neurnios
imaturos (DCX+) no DG.

(E) Degus infantis e adultos foram treinados no
medo condicionado e testado no dia 1 ou 28.

(F) Ambos apresentaram persistncia ma memria
de medo.
(G) Guineas Pig foram treinados no labirinto
aqutico e testados no dia 1 ou 28.

(H) Ambos mostraram persistncia na memria
espacial durante o teste.
Comparao entre camundongos, Degus e Guineas Pigs
(P17 e P60)
Aumentar a neurognese promove esquecimento em Degus e Guineas
Pig infantis
(A) Degus infantis foram treinados no condicionamento de medo e permaneceram
sedentrios ou VRW por 28 .

(B) Correr aumentou a neurognese e (C) induziu esquecimento da memria de medo
(D) Degus infantis foram treinados no condicionamento de medo e tratados com veculo ou
MEM por 28 dias.

(E) Tratamento com MEM aumentou a neurognese e (F) induziu esquecimento da memria
de medo.
(G) Guineas Pig infantis foram tratados com veculo ou MEM e aps treinados no teste de
labirinto aqutico.

(H) Tratamento com MEM aumentou a neurognese e (I) induziu esquecimento da
memria espacial.
Concluso
A observao de que a neurognese persiste na idade adulta levou idia de que a
neurognese modula a funo de memria do hipocampo, promovendo a degradao de
memrias dependentes do hipocampo e reconfigurando circitos DG-CA3;

Como a neurognese reconfigura circuitos do hipocampo, isso pode reduzir a capacidade
de um dado conjunto de estmulos (ou entradas) para reinvocar o mesmo padro de
atividade;

Durante a infncia, quando os nveis de neurognese so elevados, altos ndices de
memrias dependentes tornam-se inacessveis posteriormente;

Durante a idade adulta, quando os nveis de neurognese so menores, as lembranas
so mais resistentes deteriorao;

O aumento artificial da neurognese suficiente para induzir o esquecimento.