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Cours de

microbiologie
Prambule au cours de
Grard LOISEAU

Plan du cours
1. Le monde microbien
1.1 Dfinition
1.2 Historique
1.3 Domaines dtude et applications
2. Structure et morphologie des cellules
2.1 La cellule eucaryote
2.2 La cellule procaryote
2.3 Comparaison
3. Mthodes dtudes et culture
3.1 Isolement pour lobtention dune souche pure et macroscopie des
colonies
3.2 Observation microscopique et tests enzymatiques
3.3 Nutrition des bactries et types trophiques
3.4 Lnergie dans la cellule et les ractions doxydo-rductions
3.5 Conditions physico-chimiques de croissance
4. Cl dichotomique des principaux groupes impliqus dans les IAA

1.1 dfinition
Le terme microbe :
micro = petit + bios = vie
Ce terme trs gnral est utilis pour dsigner les
organismes trop petits pour tre observables
lil nu. Ce terme regroupe : les virus, les
bactries, les champignons microscopiques, les
protozoaires et certaines algues
Dans ce cours, on sintressera plus
particulirement aux bactries.


Microorganisme
Taille
approximative
Nature des
cellules
Virus
0,01 0,25 m Acellulaire
Bactries
0,1 10 m Procaryote
Myctes
> 10 m Eucaryote
Protozoaires
> 10 m

Eucaryote

Algues
> 10 m

Eucaryote

La classification scientifique actuelle des espces est issue de celle de Linn et divise
le monde vivant en cinq rgnes. Elle reste une classification importante car elle imprgne
encore de nombreux crits, souvent rcents, ou mme les manuels scolaires.

les procaryotes (bactries et
archobactries)

les protistes (eucaryotes
unicellulaires)

les champignons (eucaryotes
multicellulaires)

les vgtaux (eucaryotes
multicellulaires)

les animaux (eucaryotes
multicellulaires)
1.2 Historique
Les microorganismes sont utiliss depuis lantiquit pour produire et
conserver des aliments :
On attribue la production de vin Dyonisos (Grce Antique)
Fermentation du lait (fromages) et de jus de fruits

Anton VAN LEEUWENHOEK (1632-1723), drapier hollandais et grand amateur de
loupes et instruments d'optique, met au point le premier microscope en 1715 : il
dcrit entre 1674 et 1687 le monde microbien ( les animalcules ).

Lessor de la microbiologie commence partir du milieu du XIXe sicle la suite
des travaux de Louis PASTEUR et de ses lves.
Louis PASTEUR (1822-1895) :
tude des fermentations lactique, alcoolique, actique
Mise au point dun procd thermique de destruction des microorganismes : la pasteurisation puis en
association avec CHAMBERLAND la strilisation en 1877
Robert KOCH (1843-1910) :
Mise au point des techniques disolement, de culture et didentification des bactries
KOCH et PASTEUR sont les fondateurs de la microbiologie mdicale et leurs travaux sont lorigine
de limmunolgie avec les 1res vaccinations
La coloration diffrentielle de Gram est mise au point par GRAM en 1884


Au cours des annes 1875-1910 : dcouverte de la plupart des agents infectieux des maladies
les plus courantes de lpoque (maladie du charbon, typhode, tuberculose, cholra, ttanos,
diphtrie, peste, syphilis, botulisme ....) et mise au point des techniques daseptie en microbiologie
1882 : balbutiement de la virologie (IWANOWSKI)
Guerre de 1914-1918 : mise au point du vaccin antittanique
FLEMMING dcouvre la pnicilline en 1929 : 1er antibiotique (action sur les coques G+/- et
bacilles G+)
1935 : naissance de la virologie (STANLEY)

1944-1960 : lge dor des antibiotiques (dcouverte et synthse par les bactries)

A partir des annes 1950 : naissance de la biologie molculaire
AVERY dcouvre en 1944 que lADN est le support de linfromation gntique
WATSON et CRICK dcouvrent la double hlice dADN
Cette discipline est la convergence de la gntique et de la biochimie : tude des gnes, de leur
rgulation, de la synthse des protines, du dcryptage du code gntique. Le matriel dtude est
souvent la bactrie ou la levure.




1.3 Domaine dtude et applications
Le type daction des microorganismes est soit favorable soit nuisible pour
lenvironnement dans lequel ils voluent.

Environnement :
Action + : les microorganismes interviennent dans le recyclage du C, de N, du P, en
association symbiotique avec les plantes. Ils maintiennent la fertilit des sols; certains
permettent llimination des composants toxiques prsents dans les sols, parfois, ils sont les
agents de contrle biologique des maladies des plantes.
Action - : certains microorganismes sont pathognes et sont responsables de la destruction
de nombreuses cultures.

Mdecine :
Action + : certains microorganismes sont capables de synthtiser des molcules toxiques vis
vis dautres espces (antibiotiques, )
Action - : de nombreux microorganismes sont des agents infectieux, responsables de
Maladies infectieuses lorsquils se dveloppent en trs grand nombre dans un
organisme (pouvoir invasif)
Toxi-infections lorsquils secrtent des toxines (enzymes, protines, toxines plus
complexes comme le LPS (LipoPolySaccharide).
Exemples : neurotoxines (site daction le systme nerveux), entrotoxines (site daction lintestin),
hmolysines (destruction des tissus)

Alimentaire :
Action + : les microorganismes interviennent dans la fermentation voulue et contrle des
matires premires et transforment les aliments de base (fermentation du lait en fromage ;
fermentation de jus de fruit en vin, bire ; fabrication du pain ; fabrication du saucisson ; .)
Action - : certains microorganismes sont responsables de toxi-infections alimentaires car les
microorganismes pathognes sont frquemment vhiculs par les aliments ; dautres sont
des contaminants des aliments et peuvent les rendre impropres la consommation.

Biotechnologie :
Certains microorganismes sont utiliss pour la production de nombreux produits chimiques
production denzymes comme les amylases (domaine des lessives), les cellulases et les
pectinases (industrie des confitures)
production dacide actique
production de polypeptides usage pharmaceutique (microorganismes clns)

Recherche :
Les microorganismes sont des modles organiques trs intressants pour la recherche car ils sont plus
maniables que les plantes et les animaux (et pas de problmes dthique). De plus, on peut
disposer de millions de copies dune mme cellule et cela entrane donc une facilit dtude.
2. Structure et morphologie des
cellules microbiennes
2.1 La cellule eucaryote
rgne des protistes
Protozoaires
Algues microscopiques
Champignons microscopiques : levures et moisissures
organisation biologique
Unicellulaire : 1 10 m
Certains sont pluricellulaires

Les cellules eucaryotes (eu- : Vrai et caryo- pour noyau)
possdent un vritable noyau. En effet, le matriel gntique
est spar du cytoplasme par une double membrane dite
enveloppe nuclaire.

Elles possdent un nombre paire de chromosomes.


On distingue parmi les cellules eucaryotes des cellules de type
animal et des cellules de type vgtal.
Les organismes eucaryotes peuvent tre soit des unicellulaires
(uni-: un ; cellulaire : cellule) comme les protozoaires, certaines
algues, certains champignons soit des pluricellulaires (pluri- :
plusieurs). Chez les pluricellulaires, les cellules (pouvant tre de
type animal ou vgtal) sont regroupes en tissus et sont le
sige de fonctions spcialises.
La cellule animale
Rticulum
endoplasmique
rugueux
Membrane
plasmique
Cytosquelette
Les cellules animales sont les constituants de base des organismes animaux
pluricellulaires : mammifres, oiseaux, reptiles, batraciens, insectes et unicellulaires :
protozoaires, champignons. Le schma ci-dessous reprsente une cellule animale type.
Hyaloplasme
Noyau
Mitochondries
Vacuoles
Vsicules
golgiennes
Appareil de
Golgi
Centriole
Grossissement x 10 000
Ribosomes
Electronographie
La cellule vgtale
Chloroplastes
Paroi
pectocellulosique
Membrane
cytoplasmique
Appareil de
Golgi et
vsicules
Les cellules vgtales sont les constituants de base des organismes vgtaux : suprieurs
(arbres, plantes fleurs ) et infrieurs (fougres et mousses). Le schma ci-dessous
reprsente une cellule vgtale type.
Grossissement x 2000
Vacuole
Mitochondries
Hyaloplasme
Noyau
Rticulum
endoplasmique
Ribosomes
Organites spcifiques des
cellules vgtales
Organites communs aux cellules
vgtales et animales
Cytosquelette
Electronographie
Les lments constants des
cellules eucaryotes
La membrane plasmique
Le noyau
Les mitochondries
Le rticulum endoplasmique et les ribosomes
Lappareil de Golgi
Le cytosquelette
Le hyaloplasme


La membrane plasmique
La membrane plasmique constitue une vritable frontire slective entre le hyaloplasme et le milieu
extracellulaire. Cest une structure de 7 8 nm. Au microscope lectronique, elle apparat forme de
deux feuillets sombres spars par un feuillet clair. Les analyses chimiques montrent que la
membrane cytoplasmique contient environ de 50 60% de lipides dont la plupart sont des
phospholipides et 50 40% de protines. La membrane nest pas fige, les lipides et les protines qui
la constituent se dplacent, on parle de mosaque fluide.
Dans les cellules, la membrane plasmique assure plusieurs fonctions :
1- Rle dchange avec le milieu extracellulaire : soit directement travers la bicouche
lipidique soit par lintermdiaire de protines de transport.
2- Rle de contenant : Elle maintient les organites cellulaires dans un espace limit
3- Rle dans les processus de reconnaissance : dautres cellules, de molcules.
Zoom
Bicouche lipidique
Milieu
extracellulaire
Hyaloplasme
Phospholipides
Protines
Zoom
Membrane plasmique x 650 000
Milieu
extracellulaire
Hyaloplasme
Microscopie lectronique
Noyau x 4000
Microscopie lectronique
hyaloplasme
Le noyau ou matriel nuclaire
Le noyau des cellules eucaryotes a une diamtre moyen de 10 15 m. Il est gnralement
sphrique mais il peut tre polylob comme dans les polynuclaires. Il comprend un double
membrane appele enveloppe nuclaire parseme de petits trous, les pores nuclaires. Il
contient un gel appel nucloplasme et de la chromatine. Cette dernire est forme de
protines et dADN (Acide DsoxyRibonuclique) qui contient linformation gntique. On
trouve aussi une structure plus dense plus ou moins sphrique appel le nuclole.
Enveloppe nuclaire
Nuclole
Nucloplasme
Chromatine
Pore
nuclaire
Le noyau contient la majeur partie de linformation gntique de la cellule cest dire
linformation ncessaire la production des constituants cellulaires et la gestion de son
activit. Il a la charge de lexprimer (transcription), de la transmettre ses descendances
(rplication au cours de la mitose) et de maintenir son intgrit (rparation).
hyaloplasme
mitochondrie
Mitochondrie x 20 000
Microscopie
lectronique
Les mitochondries
Les mitochondries sont des organites cellulaires dune longueur de 1 10 m et de 0.5 1
m de diamtre. Elles sont formes dune double membrane (interne et externe). La
membrane interne forme des replis appels crtes. La membrane externe est en contact
avec le hyaloplasme. Elles sont remplies dun gel, la matrice.
Membrane externe
Espace
intermembranaire
Membrane interne
Matrice
Dans les cellules, les mitochondries assurent 2 fonctions principales:
1- Rle dans la production dnergie : Les mitochondries produisent la grande majorit
des molcules dATP (Adnosine TriPhosphate). Cette dernire est utilise pour assurer
les processus cellulaires ncessitant de lnergie : transports membranaires,
dplacement, synthse etc.
2- Rle dans la synthse des hormones strodes : Les mitochondries participent la
synthse des hormones strodes telles que la progestrone, les oestrognes et la
testostrone.

Les mitochondries contiennent de nombreuses enzymes et possdent leur propre A.D.N.
(A.D.N.mitochondrial)
Elles sont essentielles dans les processus nergtiques cellulaires.
Elles peuvent se multiplier en fonction des besoins nergtique de la cellule.
L'ensemble des ractions qui fournit de l'nergie au sein de la mitochondrie constitue la respiration
cellulaire

Dans la matrice mitochondriale sont ralises un ensemble de ractions appel "cycle de krebs" qui
concernent lactyl coenzyme A, driv du pyruvate. Le pyruvate a t pralablement form dans le
hyaloplasme des cellules, au cours de la glycolyse partir des oses (glucose, etc).
Lactyl coenzyme A va tre oxyd en dioxyde de carbone et permettre paralllement la rduction de
coenzymes (NAD+ en NADH, H
+
)
Les coenzymes rduits sont r-oxyds sur la chane des cytochromes aux niveaux des crtes
mitochondriales pour gnrer de lATP. Cest la phosphorylation oxydative.

Loxydation complte d'une molcule de glucose fournira 38 molcules d' A.T.P.
Chaque molcule d'A.T.P. pourra tre ensuite hydrolyse en A.D.P.+ P + nergie en fonction des besoins
nergtiques cellulaires
La raction A.D.P. + P + Energie fournit une nergie de 7kcal / mol.

La mitochondrie est aussi implique dans le mtabolisme des lipides, en particulier loxydation des
acides gras qui fournit aussi des coenzymes rduits qui seront r oxyds sur la chane des cytochromes.

Les mitochondries
Schma du mtabolisme nergtique
dans la mitochondrie lors de la respiration
Cycle de
Krebs
NADH,H
+
Les ribosomes et le rticulum endoplasmique
Le rticulum endoplasmique est un systme de membrane en relation avec lenveloppe
nuclaire. On distingue le rticulum endoplasmique rugueux qui porte des ribosomes sa
surface et le rticulum endoplasmique lisse qui nen porte pas. Les ribosomes peuvent tre
aussi libres dans le hyaloplasme. Ceux-ci sont forms de 2 sous-units accoles plus ou
moins sphriques : une petite et une grande.
Le rticulum endoplasmique et les ribosomes interviennent dans la synthse des protines.
Le rticulum endoplasmique lisse est implique dans la synthse des lipides comme les
hormones strodes.
Rticulum
endoplasmique
rugueux
x 3 000
Microscope lectronique
Ribosomes
x 400 000
Microscopie
lectronique
Membrane
Ribosome
Grande
sous unit
Petite
sous unit
ZOOM
Appareil de Golgi x 2500
Microscopie lectronique
Lappareil de Golgi et ses vsicules
Lappareil de Golgi est form dun ensemble de sacs membranaires longilignes appels dictyosomes et
se terminant pour la plupart par des renflements se scindant en vsicules. Chaque dictyosome
comprend 4 10 saccules empils. Lappareil de Golgi est gnr partir du rticulum
endoplasmique rugueux.
Lappareil de Golgi assure plusieurs fonctions au sein de la cellule :
1- Maturation et tri des protines : Les protines produites dans le rticulum endoplasmique rugueux
subissent, au niveau de lappareil de golgi, des transformations chimiques qui leur confrent dune part leur
activit biologique et dautre part leur localisation cellulaire.
2 - Production de lysosomes : Les lysosomes sont des vsicules Golgiennes chargs de dgrader les
macromolcules (lipides, protides, acides nucliques, glucides) grce aux enzymes quelles renferment.
Vsicule
Golgienne
Dictyosome
Le cytosquelette
Le cytosquelette est un rseau de filaments protiques en constant remaniement et prsent
dans toutes les cellules eucaryotes.
Il assure de multiple rle dans la cellule : maintient de la forme , mouvement des cellules,
division cellulaire, dplacement des organites et des vsicules dans le hyaloplasme.
Cytosquelette :
rseau de protines
Cytosquelette x 250 000
Microscopie
lectronique
Le hyaloplasme
Le hyaloplasme ou cytosol est un des composants importants du cytoplasme. Le hyaloplasme
correspond lensemble des constituants du cytoplasme mis part les organites. Cest un gel trs riche
en eau environ (70 90%), en sels minraux et en protines (20 50% des protines cellulaires). Ce gel
nest pas fig mais en constant mouvement.
Le hyaloplasme assure plusieurs fonctions dans la cellule : participe au mouvement des organites, il est
le lieu de nombreuses ractions biochimiques (synthse et dgradation).
Les lments inconstants des
cellules eucaryotes
Pour les cellules de type animal :
Les centrioles
Les flagelles et les cils

Pour les cellules de type vgtal :
Les flagelles
Les chloroplastes
Les vacuoles
La paroi pectocellulosique
Les centrioles
Le centriole est une structure protique cylindrique de 0,4 m de long et de 0,2 m de
diamtre. On la met en vidence uniquement dans les cellules animales.
Le centriole intervient dans une tape importante du cycle cellulaire : la mitose (division du
noyau de la cellule).
Microtubules
protiques
et
cylindriques
Centriole x 80 000
Microscopie lectronique
Les flagelles et les cils
Les cils et flagelles sont associs au mouvement cellulaire. Ils diffrent par la longueur
(5 20 m pour les cils et 100 200 m pour les flagelles) et par leur mouvement.
Le mouvement des flagelles est ondulatoire et gnre des ondes planes ou hlicodales
venant de la base ou du sommet du flagelle. La cellule est tire ou pousse dans leau.
Le mouvement des cils correspond un battement en 2 phases : une phase o le cil est
raide et rame dans leau, une phase o le cil se courbe et retourne sa position
initiale. Un microorganisme cili coordonne les battements de telle sorte que tous les
cils ne soient pas dans la mme phase en mme temps.

Au niveau composition et structure, ils sont trs semblables. Ce sont des cylindres de 0,2
m de diamtre lis la membrane plasmique. Ils sont constitus de 2 types de
protines : la tubuline et la dynine. LATP est ncessaire aux mouvements des cils et
flagelles (hydrolyse de lATP par la dynine).
Les chloroplastes
Les chloroplastes sont des organites cellulaires spcifiques des cellules vgtales. Ils ont une
longueur de 4 8 m et de 2 4 m de diamtre. Ils sont forms dune double membrane (interne
et externe) quon appelle enveloppe. Ils sont remplis dun gel, le stroma. Ils contiennent des petits
sacs entours dune membrane : le thylakodes et contenant des pigments comme la chlorophylle
(origine de leur couleur verte). On compte environ 15 40 chloroplastes par cellule.
Les chloroplastes ont un double rle dans les cellules vgtales :
1 - Rle dans la production dnergie : Les chloroplastes convertissent lnergie lumineuse
(nergie rayonnante) en nergie chimique directement utilisable par la cellule : lATP
(Adnosine Triphosphate) en produisant de loxygne. Cest la photosynthse.
2 - Rle dans la synthse damidon : Les chloroplastes fixent le dioxyde de carbone
atmosphrique (cycle de Calvin) et synthtisent des biomolcules glucidiques comme
lamidon. Ce dernier constitue une vritable rserve dnergie.
hyloplasme
Chloroplaste x 10000
Microscopie lectronique
Enveloppe
Stroma
Thylakodes
La paroi pectocellulosique
Les vacuoles
La paroi pectocellulosique est la structure la plus externe des cellules vgtales. Elle est constitue de
longues fibres de cellulose et pectine imbriques les unes aux autres ce qui lui confre une forte rigidit.
Chez les myctes, la paroi est souvent constitue de chitine, de cellulose et de glycane.
Elle joue un Rle de protection des cellules vgtales.

Les vacuoles sont des sacs membranaires de petite taille dans les cellules animales (0,5 1 m de
diamtre) et de trs grande taille dans les cellules vgtales (10 70 m de diamtre). Chez ces
dernires, elles contiennent de leau (90 95%), des sels minraux, des pigments et des tannins.
Dans les cellules vgtales, les vacuoles assurent 2 fonctions importantes :
1- Rle de stockage : Les vacuoles constituent de vritables rserves de nutriments (glucides, protides),
sels minraux, eau. Elles stockent galement des dchets qui peuvent se montrer toxiques pour la cellule
elle-mme et pour les consommateurs de ces cellules.
2- Rle dans la croissance des cellules : En augmentant de volume, la vacuole exerce une pression sur
la paroi pectocellulosique qui croit lorsque celle-ci est encore jeune et donc lastique.
Exemples de cellules eucaryotes
unicellulaires
Protozoaires




















Protozoaire flagell : Trypanosome Paramcie

La mitochondrie du trypanosome est gante et possde un kintoplaste contenant lADN codant pour lARN et
les protines mitochondriales
Algue
2. Structure et morphologie des
cellules microbiennes
2.2 La cellule procaryote

Les cellules bactriennes sont
dites procaryotes (pro- : Avant &
caryo- : noyau) car elles ne
possdent pas un vritable
noyau. Le matriel gntique est
directement en contact avec le
cytoplasme. Il est form dun seul
chromosome.
La cellule bactrienne
Grossissement x10 000
Les bactries sont des micro-organismes vivants exclusivement unicellulaires. Elles
sont formes dlments constants (prsents dans toutes les bactries) et dlments
facultatifs (prsents que dans certaines espces et parfois sous certaines conditions). Le
schma ci-dessous reprsente une cellule bactrienne type o tous les lments constitutifs
sont reprsents.
Pili
Spore
Plasmide
Flagelle
Capsule
Elments facultatifs
Paroi
Membrane
plasmique
Nuclode
Cytoplasme
Elments constants
Les lments constants des
cellules procaryotes

La membrane plasmique
La paroi bactrienne
Le nuclode et lADN



La membrane plasmique


Constitue de phospolipides
Constitue de protines (trs nombreux types)
Composition globale :
10 % glucides
30 % lipides
60 % proteines
Reprsentation en 3D









Rle de la membrane plasmique : Barrire permable de slectivit assurant

un transport passif du milieu hyperconcentr vers hypoconcentr selon le gradient de
concentration
un transport actif dans le sens inverse du gradient de concentration. Il y a donc logiquement
utilisation d'nergie et de proteines. Les molcules entrantes tant des vitamines, acides gras
ou autres.
dlimite la cellule
participe aux processus mtaboliques comme la respiration (fabrication d 'ATP), ou la
photosynthse. Exactement comme la membrane interne d'une mitochondrie.













La paroi bactrienne
La paroi bactrienne constitue un vritable exosquelette (exo- : extrieur). Elle forme une
structure rigide situe la surface externe de la membrane plasmique. Le constituant
principale est la murine ou peptidoglycane. On distingue 2 types de bactrie selon la
structure de leur paroi:
La paroi est responsable de la forme des bactries, Elle leur confre la capacit rsister
aux fortes pressions auxquelles elles sont soumises.
Il est possible didentifier ces deux types de bactries par une coloration : La coloration de
Gram. Les premires apparaissent violettes, elles sont dites Gram positives et les secondes
se colorent en rouges, elles sont dites Gram ngatives.
1- Les bactries paroi homogne : La paroi de ces bactries est paisse (15 80 nm) et
est forme essentiellement de peptidoglycane.
2- Les bactries paroi htrogne : La paroi de ces bactries a une paisseur de 6 15
nm et est constitue dune fine couche de peptidoglycane et dune membrane dite
externe de structure proche de la membrane plasmique.
Paroi dune bactrie Gram + Paroi dune bactrie Gram -
Membrane plasmique
Milieu extrieur
Peptidoglycane
Cytoplasme
1
Milieu extrieur
Membrane
externe
2
Comparaison de la paroi des Gram + (bacillus subtilis) et Gram -
(E. coli) au microscope lectronique

barre = 50 nm environ
Bacillus subtilis
E. coli
La paroi des GRAM +
mesure environ 15 a 30 nm
en une seule couche.
La paroi des GRAM - mesure
environ 15 nm en 3 couches :
1 - fine couche de PTG
(peptydoglycane)
2 - couche de proteines
diverses
3 - bicouche
phospholipidique de la
paroi (avec une structure
identique celle de la
membrane) possdant sa
surface un LPS
m:membrane plasmique
(double couches
phospholipidiques)
Le peptidoglycane : PTG : appel autrefois MURINE.

Deux parties :

1 une partie glucidique : chanes linaires de glycane (alternance de N-actylglucosamine et
dacide N-actylmuramique relis par une liaison osidique bta 1-4 ),

2 une partie peptidique :
units ttrapeptidiques relies au groupement carboxyle de lacide N-actylmuramique
ponts interpeptidiques (pas toujours prsents) : peptides plus ou moins longs reliant les
peptides prcdents.

Dans le modle issu de l'analyse
du peptidoglycane de S. aureus, les
liens sont raliss par un
pentapeptide.

Chez E. coli, le pont est absent et le
lien est direct.

Il existe donc toute une famille de
peptidoglycanes variables selon la
bactrie tudie.

La macromolcule forme par
l'ensemble est donc une sorte de
tissu entourant la bactrie. Il est
relativement rigide de par la
covalence des liaisons chimiques.

Il peut tre dtruit par le lysozyme,
enzyme hydrolysant les liaisons dans
le glycane (bta 1-4 hydrolase) et sa
synthse est inhibe par les
btalactamines, analogues de D-ala-
D-ala, dimre intervenant dans la
synthse du peptidoglycane.



Autres composants de la paroi des Gram +
acides tichoques (antignes de surface
participant la cohsion de la structure paritale)
polyosides (ex polyoside C des Streptococcus).

On retrouve galement sur la membrane externe des GRAM- :

Des protines :
des porines, seules structures de transport des composs hydrophiles. Elles sont
essentielles la vie de la bactrie mais aussi l'action de certains antibiotiques.
la protine de Braun assure la cohsion structurale du peptidoglycane et de la membrane
externe.
enfin d'autres protines servant la captation d'ions (fer), ou de vitamines (facteurs de
croissance).


L'autre constituant essentiel est le LPS, ou Lipopolysaccharide : cest une molcule
antignique, porteuse de multiples proprits physiopathologiques. Le LPS est constitu de
3 parties : la chane laterale "O", le core,et le lipide complexe "A.

Le lipide "A" est un dimre de glucosamine avec 2 chanes d'acides gras, et 1 chane
d'acide phosphorique. Il est responsable des activits toxiques (endotoxine). Il est li au
feuillet externe de la membrane externe.

Le core est une chane complexe de 10 sucres inhabituels.

Enfin, l'oligosaccharide O est une partie variable et peut tre diffrente d'une bactrie
une autre. Il a une base de 5 sucres retrouvs N fois

Structure du LPS des
bactries Gram ngative



Cas particulier des spirochtes :
Chez les Spirochtes, la membrane externe et le peptidoglycane ne sont pas
relis : la membrane est alors trs souple ce qui explique le mouvement
particulier de ces germes.

Rles de la paroi
Lutte contre les chocs osmotiques :
Forme de la bactrie
Coloration de Gram : .
Fixation des phages
Filtration de molcules externes
Rle toxique
Rle antignique

COMPARAISON DES DEUX PAROIS Gram + et Gram

critres/groupes GRAM + GRAM -
paisseur 30 nm 15 nm
nombre de couches 1 2
prsence du PTG oui oui
prsence du LPS non oui
prsence de porines non oui
prsence d'acide teichoique oui non


Les cellules procaryotes ne possdent
qu'une seule molcule d'ADN.


Chez la bactrie Escherichia coli, par
exemple, presque tout l'ADN de la cellule
forme une grande boucle comportant prs de
5 millions de paires de bases.

La longueur totale de la molcule est
d'environ 1,5 mm (prs de 500 fois plus long
que la bactrie elle-mme).

Cette norme molcule contient toute
l'information ncessaire l'assemblage des
quelques 4000 protines diffrentes que
peut fabriquer cette bactrie.
Escherichia coli
Le nuclode et lADN
Contrairement aux cellules eucaryotes, lappareil nuclaire des procaryotes a une structure
diffuse et mal dlimite. Il est form dune double hlice dADN (Acide
Dsoxyribonuclique) circulaire torsade appele chromosome et associe un corps
form de protines. Lensemble est appel nuclode. LADN est directement en contact
avec le cytoplasme.

LADN existe sous deux formes :

le chromosome bactrien , gnralement unique et circulaire, de longueur de l'ordre du mm
les plasmides, facultatifs, dont le rle nest pas indispensables la vie de la bactrie (semble-t-il)

Rles de lADN :

LADN contient la majeur partie de linformation gntique de la cellule cest dire
linformation ncessaire la production des constituants cellulaires et la gestion de lactivit
de la cellule. Il a la charge de lexprimer (transcription : production dARN pour Acide
RiboNuclique), de la transmettre ses descendances (rplication) et de maintenir son
intgrit (rparation).



Tailles :
E coli a 4 639 221 pb
Bacillus subtilis : 4 214 800 pb soit 4000 gnes dont 1500 de fonction inconnue
Mycobacterium tuberculosis avec 4 411 529 pb et 4000 gnes (12 juin 1998)
Saccharomyces cerevisiae (champignon eucaryote) 13 Mpb
Les lments inconstants des
cellules procaryotes
Les flagelles et les cils
La capsule
Les pili et fimbriae
La spore
Les plasmides


Bactrie
flagelle
monotriche
x 20 000
Microscopie lectronique
Les flagelles bactriens
Les flagelles bactriens apparaissent sous la forme de longs filaments onduls de 5 25
m de long et dune paisseur variable de 11 nm 25 nm. Ils sont constitus dune
protines appeles la flagelline.
Flagelles
Selon le nombre et la position des flagelles sur le corps bactrien, on distingue 4 modes
dinsertion :
Les flagelles servent essentiellement la propulsion des bactries. Ils fonctionnent de la
mme manire quun moteur de bateau. La rotation du flagelle entrane le corps bactrien.
Les changements de sens de rotation du flagelle produisent une culbute et provoque un
changement de direction.
Systme polaire Systme monotriche Systme lophotriche Systme pritriche
Corps bactrien
Vue au microscope lectronique dune bactrie mobile
Proteus mirabilis : coloration des cils par le mthode de
Rhode (paississement au nitrate dargent ammoniacal)
Proteus vulgaris
Mise en vidence des cils et des flagelles

Directe
Coloration des cils
La coloration des cils est une coloration trs dlicate et qui ne fonctionne pas trs bien en gnral.
Elle consiste raliser une imprgnation d'Ag sur les cils, trop fins pour tre vus en microscopie
optique (20 nm). Les cils sont au pralable tanns.
Deux types principaux de ciliature sont mis ainsi en vidence : pritriche et polaire

Microscopie lectronique
Les colorants de la microscopie lectronique et son grossissement permettent de voir sans problmes
les cils.

Indirecte (par la mobilit)
Etat frais
La mobilit, gnralement lie aux cils et flagelles (sauf pour des bactries de l'environnement mobiles
par glissement), est la meilleure mthode pour savoir que la bactrie est cilie. Encore faut-il qu'il soit
correctement ralis, en particulier avec des souches fraches, en suspension dans un bouillon nutritif.

Glose molle
Les gloses molles, ensemences par piqre en tube, peuvent permettre de voir, par la diffusion du
trouble, la mobilit des bactries dans le milieu. Le prototype est le milieu Mannitol-Mobilit.

Envahissement des milieux par les bactries (swarming)
Certaines bactries, essentiellement du groupe Proteus-Providencia, sont capables de se dplacer la
surface de la glose par vagues successives. Elle "nagent" ou "essaiment (swarming)" la surface de
la glose.
Cette observation est essentielle pour l'identification des bactries

Les cils ou flagelles des procaryotes sont des polymres d'une protine baptise flagelline. Les
expriences concernant l'osmose montrent que les cils sont implants dans la membrane
plasmique et non dans la paroi. Les cils traversent donc la paroi.
Le cil est donc un tube creux constitu de flagelline, de masse molaire 40 kg/mol. Sa structure est
trs voisine de celle des microtubules eucaryotes.
Son implantation dans la paroi se fait par des structures spcialises et dans la membrane
plasmique une sorte de rotor va assurer son mouvement.
L'nergie est apporte par le gradient d'ions H+ qui provoque la rotation du flagelle l'instart d'un
fouet. Le mouvement pourra tre tracteur ou pousseur selon les cas.

Rles :
mouvement : c'est le rle essentiel qui permet la bactrie d'chapper aux prdateurs ou aux
mauvaises conditions et de rechercher la nourriture ou l'air.
attachement aux supports : il n'est pas exclu que l'attachement au support puisse se faire par
les cils.
antignique : c'est l'Ag H (Ho ou crochet) de nombreuses bactries Gram + ou -, recherche
pour Listeria, Salmonella, E. coli (0157 H7), ... mais pas bien sr pour les bactries immobiles.
entre des virus : certains virus pntrent dans la bactrie par le tube creux du cil.

Structure et Rles des cils et flagelles
La capsule
La capsule bactrienne, lorsquelle est prsente, est la structure la plus externe de la bactrie. Elle
forme la surface de la paroi bactrienne une couche plus ou moins paisse parfaitement dfinie.
Dans la majorit des espces bactriennes qui la produise, elle est de nature glucidique.
Corps Bactriens (2)
Capsule
Capsule bactrienne observe au microscope optique
aprs coloration lencre de chine (coloration ngative)
La capsule na pas de rle vital pour la bactrie. Elle constitue un primtre supplmentaire de protection.
Par exemple, elle protge la bactrie contre la phagocytose (ingestion et destruction par des cellules comme les
polynuclaires) et limite laction des antimicrobiens (antibiotiques, dsinfectants). La capsule joue un rle dans
ladhsion de la bactrie aux supports et elle est antignique (antigne K)
Bactries concernes : De nombreuses bactries pouvant tre pathognes prsentent une capsule. Dans le
domaine mdical on pourra distinguer des capsules importantes et des "microcapsules" gnralement invisibles
l'tat frais l'encre de Chine.
capsule
Streptococcus pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Bacillus anthracis (capsule polypeptidique)
Streptococcus pyogenes
microcapsule
Salmonella Typhi, ParatyphiC, Dublin : c'est l'Antigne Vi de ces trois srovars de Salmonella.
E. coli porteurs de l'Antigne K
Les pili ou fimbriae
De nombreuse bactries Gram- possdent leur surface des appendices filiformes de
nature protique. Ces appendices sont ancrs dans la membrane plasmique des
bactries. Ils ne participent pas au mouvement des cellules comme les cils et flagelles.
On distingue 2 types dappedices :

Les fimbriae : courts, rigides et prsents en grand nombre (10 400). Ils sont
constitus de piline et dadhsine.
Les fimbriae sont des facteurs dinfectiosit en assurant ladhsion spcifique de la bactrie
sur un tissu cible, premire tape dune infection par pouvoir invasif.

Les pili sexuels ou de type II : beaucoup plus longs et plus pais que les prcdents (15
20 m) et se terminent par un renflement. Ils ne sont prsents quen petit nombre (1
4).
Les pili de type II permettent lchange dinformation gntique entre 2 bactries : une
cellule donneuse, dite mle et porteuse dun pili, et une cellule acceptrice dite femelle.
Cest donc un facteur de variabilit lors de la conjugaison entre 2 bactries.

Tranfert (conjugaison) entre deux bacteries via un pili de type I I
pili de type I
Endospore x 22 500
Microscopie lectronique
La spore ou endospore
La spore bactrienne ou endospore est une petite structure ovale ou sphrique de 2 4 m
de diamtre forme dune multitude de feuillets qui lui confre des proprits extraordinaires
pour un organismes vivants. Seul un petit nombre de bactries, toutes Gram +, sont
capables de se transformer en spore : Bacillus, Clostridium et Sporosarcina.
Endospore
Corps bactrien
Lorsque les conditions deviennent dfavorables, les bactries , appartenant aux genres cits
prcdemment se transforment en spores. La transformation dure de 6 8 heures. Cest la
sporulation.
La structure particulire de la spore lui confre la capacit rsister de nombreux agents
physiques-chimiques (Temprature, ultra-violet, rayons X, ultrapression, antibiotiques,
antiseptiques ) et une extraordinaire longvit.
Germination
Conditions favorables
Sporulation
Conditions dfavorables
Endospore bactrie
Multiplication
Lorsque les conditions redeviennent favorables, les spores redonnent la forme bactrienne, qui
se multiplier. Cest la germination.
Composition chimique :
Deux lments fondamentaux :
la grande quantit de dipicolinate de Calcium (10 % en masse)
l'extrme dshydratation de la spore

Proprits de la spore :
Germination
rsistances aux agents chimiques
L'impermabilit de la spore la rend insensible de nombreux antiseptiques et
antibiotiques.
rsistance la chaleur
La plupart des spores semble rsister un chauffage de type pasteurisation, 80C - 10
min. On utilise cette proprit pour l'isolement slectif des bactries sporules. Tous les
lments internes rsistent (membrane, ribosome, DNA...) trs certainement grce la
dshydratation.
Certaines spores rsistent 100C et mme jusqu' 120C durant quelques secondes en
atmosphre humide.
La strilisation par la chaleur ncessite donc une temprature minimale de 120C qui ne
peut tre obtenue que par un chauffage sous pression car l'eau doit tre sous forme
liquide et que cela n'est possible que sous pression de 200 kPa pour une temprature
de 120C. L'appareil utilis est l'autoclave.


Sporulation
La cause ou le facteur dclenchant la sporulation n'est pas trs clair : il semble toutefois
que de mauvaises conditions (en particulier nutritives) soient un facteur dclenchant
efficace. Il semble toutefois que dans une population de bacilles capables de sporuler, il
y ait toujours des bacilles s'engageant en sporulation.
Le phnomne de la sporulation est un vritable phnomne de diffrenciation
cellulaire. Il dure 7 HEURES et la thermorsistance n'apparat qu'au bout de 6 HEURES.

Les diffrents stades sont :

1. formation d'un filament axial forms de deux ADN identiques, donc stade postrieur la
rplication.
2. sparation de ces deux ADN, l'un s'entourant d'une membrane interne.
3. formation de la prspore
4. mrissement de la prspore avec formation du cortex et dshydratation de la spore
5. agencement des tuniques et de l'exosporium, tous ces lements tant probablement
fabriqus grce lADN extrieur la prspore.
6. lyse de la cellule sous l'action de peptidoglycanases.

Germination
La cause ou le facteur dclenchant la germination n'est pas trs clair : il faut toutefois
OBLIGATOIREMENT une entre d'eau dans la spore pour qu'elle puisse germer. C'est
pourquoi un choc thermique est souvent en cause pour expliquer des dchirures des
enveloppes permettant le dmarrage du phnomne.
Dure : 30 min.
Les diffrents stades peuvent tre :
1.dchirure des enveloppes
2.pntration d'eau qui active des enzymes (notamment peptidogycanases) paritales.
3.pntration de l'eau dans le cytoplasme
4.redmarrage de l'activit cellulaire avec synthse de nouvelle paroi. Les formes
vgtatives sont videmment thermosensibles

Spores terminales dformantes
Spores de bacillus cereus
Souvent les spores sont invisibles au microscope optique, il est
ncessaire de les colorer. Ci-dessus, coloration de Gram.
Autre type de coloration : vert malachite et safranine (les spores
apparaissent vertes dans des corps bactriens roses).
Coloration des spores au vert malachite
Les plasmides
Les plasmides sont des petites molcules dADN (Acide dsoxyribonuclique) double brins
circulaires, torsades dont la taille reprsente environ 0,1 2 % du chromosome bactrien. Il est
prsent aussi bien dans les bactries Gram positive que Gram ngative. Le nombre de plasmides
par bactrie est variable de 1 plusieurs dizaines.
Les plasmides peuvent confrer la bactrie de nombreuses proprits :
1- Rsistances aux antibiotiques: La capacit rsister aux antibiotiques est une proprit qui
peut tre confre par les plasmides.
2- Rsistances au mtaux lourds: Ces plasmides protgent les bactries contre les mtaux
lourds (mercures, plombs) soit en empchant leur entre dans la bactrie soit en les
transformant en une forme moins toxique.
3- Acquisition de pouvoir pathogne : Les plasmides peuvent coder la production de toxines ou
de facteurs dadhrences (pili de type I par exemple) lorigine de pathologies (maladies).
4- Acquisition de voies mtaboliques particulires : Certaines bactries peuvent utiliser comme
lment nutritifs des composs particuliers tels que les phnols, le camphre, le naphtalne. Les
enzymes assurant ces voies mtaboliques sont cods par les plasmides.

Les ribosomes ont pour rle, en association avec les ARNt (de transfert) de traduire l'ARN
messager afin de synthtiser des proteines. Ceux-ci sont peu prs identiques aux
ribosomes eucaryotes. Ils sont au nombre de 15000 par bactrie et reprsentent 45 % du
poids sec.

Ils sont constitus de proteines ribosomales et dARN ribosomal (ARNr), ils forment deux
sous units : une grande (50S) et une petite (30S). Lorsquils sont complets, ils ont une
constante de sdimentation de 70S.
La petite unit est constitue dARNr 16S + 21 protines
La grande sous-unit est constitue dARNr 5S + ARNr 23S + 34 protines


Par comparaison, les ribosomes eucaryotes sont constitus de proteines ribosomales et
dARN ribosomal (ARNr), ils forment deux sous units : une grande (60S) et une petite (40S).
Lorsquils sont complets, ils ont une constante de sdimentation de 80S.
La petite unit est constitue dARNr 18S + 33 protines
La grande sous-unit est constitue dARNr 5,8S + ARNr 28S + 49 chanes polypeptidiques

Les ribosomes

Pendant longtemps, procaryote a t synonyme de bactrie, jusqu' la dcouverte en
1990 d'un type cellulaire nouveau, de toute vidence procaryote, mais qui ne sont pas des
bactries.

Les bactries ont donc t renommes eubactries (vrai bactries) et ce nouveau type
cellulaire archobactrie.
Ces dernires partagent avec les eubactries la possession d'un chromosome circulaire
unique et l'absence de cytosquelette. Mais elles comportent aussi des caractres
eucaoryotes tels que les gnes en mosaique et une structure gntique semblable. Ces
caractristiques intermdiaires les ont fait considerer comme les anctres des deux
groupes. Toutefois, elles disposent de particularits originales, leur membrane notamment
est constititue de lipides retrouvs nulle part ailleurs dans le monde vivant.
La principale caractristique des archeobactries, l'origine de leur popularit, est leur
capacit a survivre dans les milieux extrmes : eaux trs acides (pH < 1) ou trs sales
(mer morte) ou trs chaude ( > 120C) ou trs froides ( < 0C), bien que la plupart d'entre
elles vivent dans des milieu plus clments.

Eubactries et archobactries
3. Mthodes dtude et culture des
microorganismes
3.1 Isolement pour lobtention dune souche pure
et macroscopie des colonies
3.2 Observation microscopique et tests
enzymatiques
3.3 Nutrition des bactries et types trophiques
3.4 Lnergie dans la cellule et les ractions
doxydo-rduction
3.5 Conditions physicochimiques de croissance



3.1 Isolement pour lobtention dune souche pure et
macroscopie des colonies

ETUDE MACROSCOPIQUE DUNE COLONIE

Sur un milieu solide, on prcise toujours, la couleur du milieu avant et aprs ensemencement
(changement ventuel de coloration), la temprature dincubation et le temps dincubation.
Puis on dcrit les colonies, le plus prcisment possible selon les critres ci-dessous.
Dans le cas o il y a plusieurs types de colonies sur une mme bote, on prcise le % de chacune
dentre elles.

Forme
circulaire
bord
rgulier
circulaire bord irrgulier : par
exemple : dchiquet, crnel
amibode (colonie avec
des prolongements)
rhyzode (rseau de
filaments
entrelacs, minces)
Taille
(prciser le
diamtre)
punctiforme petite ( < 2 mm )
moyenne
( 2mm < < 3mm )
grosse ( 3 mm )
Chromognse
coloration prcise de la
colonie
pigment soluble dans le milieu
( prciser la couleur du pigment )
pigment insoluble dans le milieu
( prciser la couleur du pigment )
Opacicit transparente opaque translucide
Elvation plate bombe centre surlev centre ombiliqu
Surface lisse brillante rugueuse mate plisse poudreuse
Consistance
(en les prlevant)
muqueuse grasse crmeuse sche pulvrulente granulaire compacte
Odeur absente prsente : dans ce cas, prciser lodeur
Macroscopie des colonies
ETUDE MICROSCOPIQUE DUNE BACTRIE

On prcise toujours de quel chantillon il s'agit (nature : liquide, solide ; le type de milieu ; origine).
Puis on ralise
1. L' tat frais (examen direct d'une suspension entre lame et lamelle, objectif x 40)
II a pour but de dcouvrir la morphologie de la bactrie et son ventuelle mobilit. On doit prciser
la forme
le mode de regroupement
la mobilit (ceci est valable surtout pour des chantillons provenant d'un milieu liquide : bouillon nutritif par
exemple). Attention, les coques sont toujours immobiles.

2. La coloration de Gram (en prsence d'huile immersion sur le frottis color, objectif x 100)
Elle a pour but de :
confirmer les caractres morphologiques observs l'tat frais : forme dtaille, mode de regroupement (si le frottis a
t bien ralis), absence ou prsence de spores (dans ce cas, prciser sa position dans la bactrie et si elle est dformante
ou non).
classer la bactrie selon son caractre Gram + ou Gram.
Dans le cas d'un mlange de bactries, il faut prciser les diffrentes proportions des bactries observes.

Que ce soit l'tat frais ou la coloration de Gram, il faut tre le plus prcis possible dans les descriptions.
En ce qui concerne la forme de la bactrie : coque, bacille, cocco-bacille
Pour les coques, prciser s'ils sont gros ou petits, bien ronds ou ovodes, ...
Pour les bacilles, prciser s'ils fins ou pais, longs ou courts, trapus, ovodes, le rapport L x l

Le mode de regroupement est souvent un critre important dans l'identification des coques
des coques en grappe correspondent souvent au genre Staphylococcus
des coques en chanette correspondent souvent au genre Streptococcus
des coques en ttrade correspondent souvent au genre Micrococcus

3.2 Observation microscopique et tests enzymatiques
Ralisation dun frottis

Dposer cte cte sur une lame propre :
- tout dabord, une goutte deau strile si la culture est prleve sur glose
- puis une petite parcelle de la colonie prleve laide dun instrument strile (se ou pipette pasteur
boutonne flambes). Y incorporer progressivement leau strile de faon obtenir une suspension homogne pas
trop dense.
Il est aussi possible de dposer une goutte de milieu liquide incub ou une goutte de suspension.
Raliser le frottis en partant du centre de la lame et en dcrivant avec linstrument un mouvement circulaire de
faon obtenir un talement mince et homogne de 1 2 cm
2
.
Striliser lse ou la pipette boule en la passant dans la flamme.
Laisser scher le frottis en dposant la lame prs du bec bunsen. Attendre que le frottis soit bien sec avant de le
fixer.
Fixer le frottis. Pour cela 2 techniques sont possibles :
- fixer le frottis dans la flamme sans trop le chauffer : passer la lame (face sans frottis) vers la flamme 3 fois
une seconde, en tenant la lame avec une pince.
- fixer le frottis lthanol : recouvrir le frottis sch dthanol puis aprs avoir limin lexcs dalcool dans le
bac plastique prvu cet effet, flamber le frottis (fixation lalcool et la chaleur). Attendre 3 secondes et souffler sur
la flamme afin de lteindre.
Le frottis tant fix, la lame ne prsente plus aucun danger de contamination.



Coloration de Gram
Principe
Il sagit dune coloration diffrentielle base sur des diffrences de structure de la paroi bactrienne et qui permet de distinguer 2
groupes de bactries : les Gram-positives (Gram +) et les Gram-ngatives (Gram -).
En effet, la paroi des bactries Gram - est constitue dune forte proportion de lipides contrairement celle des Gram +.
Technique
Recouvrir le frottis fix d'une solution de violet de gentiane phniqu. Laisser agir une minute au maximum.
Rejeter le colorant en inclinant la lame.
Recouvrir avec du lugol (solution aqueuse d'iode et d'iodure de potassium) pendant 30 secondes. LI2 agit comme un mordant
: il permet une meilleure coloration.
Laver leau (non obligatoire).
Laisser couler goutte goutte de l'alcool 90 sur la prparation tenue incline ; sarrter avant que lalcool ne s'coule
compltement incolore.
Laver rapidement l'eau.
Laisser de l'eau sur la lame et verser quelques gouttes de fuchsine de Ziehl dilue. Laisser agir environ 45 secondes (colorant
de contraste).
Laver l'eau ; goutter ; scher.
Ne pas jeter les colorants dans lvier mais dans le bac plastique prvu cet effet.
Remarque
Le traitement par lalcool entrane :
chez les bactries Gram +, une diminution de la permabilit de la paroi (dshydratation) ; le complexe violet de gentiane / I2
se trouve pig dans la cellule.
chez les bactries Gram -, une augmentation de la permabilit de la paroi (solubilisation et extraction des lipides) ; le
complexe violet de gentiane / I2 est limin au cours de ce traitement. Pour mieux visualiser ces cellules, un deuxime colorant
est utilis (fuschine).
Lecture du rsultat
La lecture seffectue gnralement lobjectif 100 (huile immersion).
Les bactries Gram + sont colores en bleu ou violet.
Les bactries Gram - sont colores en rouge ou rose.


Catalase

Pour les bactries Gram positif, la recherche de la catalase est un des premiers critres d'orientation.
Principe
En prsence doxygne, certaines ractions du mtabolisme bactrien sont gnratrices de peroxyde d'hydrogne H
2
O
2
telles
que la roxydation spontane du coenzyme FADH
2
.
H
2
O
2
peut aussi tre le produit de l'activit de la super-oxyde dismutase, l'ion super-oxyde rsultant de l'action de l'oxygne sur
diverses molcules organiques .....
H
2
O
2
est toxique pour les cellules (il est d'ailleurs utilis comme antiseptique). Sa dcomposition dans l'organisme microbien
peut tre ralis soit par des peroxydases, soit par la catalase.
La raction catalyse par la catalase est la suivante :
2 H
2
O
2
O
2
+ 2 H
2
O

Les microorganismes anarobies stricts sont forcment catalase ngative . Parmi, les microorganismes arobies seuls
certains sont catalase ngative , la grande majorit tant catalase positive .
Technique
Placer sur une lame une goutte deau oxygne (10 volumes).
A partir d'un milieu, solide et non slectif de prfrence, prlever l'aide d'une pipette Pasteur boutonne par exemple une
quantit suffisante de la colonie isole (pure) et la mettre en suspension dans la goutte d'eau oxygne.
Lecture du rsultat
S'il apparat des bulles d'oxygne : la bactrie est dite catalase +.
S'il n'apparat pas de bulles d'oxygne : la bactrie est dite catalase -.
Remarque
Ce test peut tre directement ralis sur la glose en dposant une goutte deau oxygne sur une colonie isole.
Dans ce cas, il est impratif de sassurer que la glose ne donne pas elle-seule une rponse positive.
Cause derreurs :
Ralisation du test partir dune colonie isole sur une glose au sang qui possde une activit catalasique naturelle.
Eau oxygne prime.

Oxydase

Pour les bactries Gram ngatif, la recherche de l'oxydase est un des premiers critres d'orientation.
Principe
En bactriologie, le caractre oxydase + d'une bactrie dcoule de la prsence chez celle-ci d'une enzyme ragissant avec un
driv mthyl du paraphnylne diamine.
La recherche de cette activit oxydasique consiste donc mettre en vidence la capacit de la bactrie teste oxyder la
forme rduite incolore de drivs N-mthyls du paraphnylne diamine, en leur forme oxyde semi-quinonique rose violac.
Technique
Placer sur une lame un disque de papier et l'imbiber du ractif (chlorhydrate ou oxalate de N,N-dimthyl paraphnylne
diamine).
A partir d'un milieu, solide et non slectif de prfrence, prlever une quantit suffisante de la colonie isole (pure) et la dposer
sur le disque.
Linstrument servant prlever la colonie ne doit pas oxyder le ractif (se servir dune pipette Pasteur boutonne par exemple).
Lecture du rsultat
S'il apparat une tache violette : la bactrie est dite oxydase +.
S'il n'apparat pas de coloration violette : la bactrie est dite oxydase -.
Cause derreurs :
Faussement positive : si utilisation dune ose mtallique, si linoculum provient dun milieu color, si la lecture est tardive
Faussement ngative : si linoculum est trop faible, si la raction est lente


Type trophique et respatoire des bactries




Le type trophique est dfini en fonction de :
la nature de la source initiale d'nergie qui sera convertie en ATP par la cellule (lumineuse = photo ; chimique = chimio)
la nature du donneur d'lectrons (compos organique = organo ; compos inorganique = litho)
la nature de la source de carbone utilise par la cellule (compos organique = htro ; CO
2
= auto ; les deux possibilits = mixo)




Type d'ENERGIE Nature du DONNEUR D'ELECTRON source de CARBONE
substance rductrice substance oxyde + n lectron
le donneur d'lectron va tre
oxyd





MINERAL lithotrophes photolithotrophes

CO
2
photolithoautotrophes




LUMINEUSE phototrophes




ORGANIQUE organotrophes photoorganotrophes

organique photoorganohtrotrophes







3.3 Nutrition des bactries et types trophiques

Type trophique et respatoire des bactries




Le type trophique est dfini en fonction de :
la nature de la source initiale d'nergie qui sera convertie en ATP par la cellule (lumineuse = photo ; chimique = chimio)
la nature du donneur d'lectrons (compos organique = organo ; compos inorganique = litho)
la nature de la source de carbone utilise par la cellule (compos organique = htro ; CO
2
= auto ; les deux possibilits = mixo)




Type d'ENERGIE Nature du DONNEUR D'ELECTRON source de CARBONE
substance rductrice substance oxyde + n lectron
le donneur d'lectron va tre
oxyd



CO
2
chimiolithoautotrophes




MINERAL lithotrophes chimiolithotrophes



organique
CHIMIQUE chimiotrophes

CO
2
chimiolithomixotrophes




ORGANIQUE organotrophes chimioorganotrophes

organique chimioorganohtrotrophes


Lorsque les microorganismes ncessitent des facteurs de croissance (acides amins, vitamines, bases puriques et pyridimiques) : on les dit auxotrophes vis--vis du
compos. Lorsqu'ils ne ncessitent pas de facteurs de croissance, on les dit prototrophes.

Les microorganismes parasites obligatoires sont apells paratrophes (bactries intracellulaire comme les Rickettsies et Chlamydies)
types trophiques suite
arobies : accepteur d'lectron = O
2

donneur d'lectron = H
2
O
Cyanobactries (Oscillatoria, Spirulina, Anabaema) et Prochlorales



photolithoautotrophes
anarobies : accepteur d'lectron n'est pas l'O
2



donneur d'lectron = H
2
S ; H
2

Bactries sulfureuses vertes (Chlorobium) et Bactries sulfureuses pourpres (Chromatium, Thiocapsa)


photoorganohtrotrophes Bactries pourpres non sulfureuses anarobies (Rhodospirillum)
donneur d'lectron : alcool, acide gras,


pour la grande majorit arobies : accepteur d'lectron = O
2

donneur d'lectron = NH
3
, NO
2
- : bactries nitrifiantes (Nitrosobacteriaceae oxydent NH
3
en NO
2
- et Nitrobacteriaceae oxydent NO
2
- en NO
3
-)
donneur d'lectron = CH
4
: bactries mthanotrophes Methylomonas, Methylococcus, ...
chimiolithoautotrophes

donneur d'lectron = Fe
2+
: bactries ferooxyadantes en milieu acide



anarobies strictes : accepteur : CO
2
et donneur : H
2
bactries mthanognes et actognes (Methanococcus,, Methanosarcina,)



anarobies : accepteur d'lectron S, SO
4
2-
et donneur : H
2
: Bactries sulfatorductrices (Desulfovibrio, Desulfobacter, )
chimiolithomixotrophes anarobies : accepteur d'lectron NO
3
-
et donneur : H
2
: Bactries dnitrifiantes (rduction des NO
3
- en NO
2
- puis en N
2
voir en NH
3
)


chimioorganohtrotrophes grande majorit des bactries qui ont un intrt dans les IAA, le domaine mdical (bactries infectieuses), .
tous les types respiratoires sont rencontrs



la rduction correspond un gain d'lectrons ox + n e- red

l'oxydation correspond une perte d'lectrons red ox + n e-

La raction qui se produira entre 2 couples rdox : ox1 + red2 red1 + ox2



E lev

ox 1 red 1 E1 : 1/2 O
2
// H
2
O = +0,82 V


E = - 1,14 Volt


ox 2 red 2
E2 : NADP+ // NADPH,H+ = -0,32 V

E faible
Sens naturel du flux dlectrons


Plus une molcule est riche en lectrons, plus elle a un potentiel E bas et plus elle est
potentiellement nergtique. Lorsque les lectrons sont transfrs d'un rducteur vers un
accepteur avec un potentiel rdox plus positif, de l'nergie libre est libre. Le G de la raction
est en relation directe avec le E des 2 couples redox concerns. G = -n.F.E avec n le
nombre d'lectrons transfrs et F la constante de Faraday (=96,5 J/mol-volt).

sens des
potentiels
rdox
croissants
3.4 Lnergie dans la cellule et les ractions doxydo-
rduction
L'nergie dans la cellule et les ractions d'oxydo-rduction


Dans le cas o les lectrons devront tre transfrs d'un E plus positif vers un accepteur avec un E
plus ngatif, c'est--dire dans le sens inverse de la raction se produisant naturellement, un apport
d'nergie sera ncessaire. C'est ce qui se passe lors de la photosynthse : l'nergie lumineuse est
capte par des pigments et utilise pour transporter les lectrons de H2O (E= 0,82 V) par exemple,
vers un accepteur E infrieur comme le NADPH,H+ (E= -0,32 V). Puis le transfert des lectrons du
NADPH,H+ vers d'autres accepteurs E suprieur permettra la cellule de synthtiser de l'ATP.

E lev

ox 1 red 1 E1 : 1/2 O
2
// H
2
O = +0,82 V


nergie lumineuse E = 1,14 Volt


ox 2 red 2
E2 : NADP+ // NADPH,H+ = -0,32 V

E faible
Sens inverse du flux naturel dlectrons
Le couple NAD+ // NADH,H+ ayant un E trs ngatif, c'est souvent NADH,H+ qui donne ses
lectrons. Les accepteurs peuvent tre trs divers.



sens des
potentiels
rdox
croissants
Dfinition

Le terme respiration implique le transfert des lectrons d'un donneur (compos rduit
bas potentiel E) un accepteur (oxydant haut potentiel E) par le biais de ractions
rdox squentielles via une chane de transporteurs trs spcialise se trouvant dans
la membrane plasmique des bactries. Le passage des lectrons au travers des
transporteurs est couple une translocation des H+ vers l'extrieur de la cellule, ce
qui va entraner une concentration en H+ suprieure l'extrieur de la cellule. Le retour
de ces H+ au travers de l'ATP synthtase sera coupl la production d'ATP.

La respiration des bactries dpend de la nature de l'accepteur ultime des lectrons :

si c'est l'O
2
= bactries arobies et respiration arobie

si ce n'est pas l'O
2
= bactries anarobies strictes ou aroanarobies et :

respiration anarobie dans le cas o l'accepteur est :
minral : NO
3
-
, SO
4
2-
,
organique : alcool, acide,



Dfinition



Le terme fermentation implique le transfert des lectrons d'un donneur
(compos rduit bas potentiel E) un accepteur (oxydant potentiel E
suprieur de celui du donneur) par le biais de ractions rdox squentielles se
droulant dans le cytoplasme des bactries. Souvent (mais pas
systmatiquement), le passage des lectrons est couple la production d'ATP,
par phosphorylation au niveau du substrat, et la roxydation du NADH,H+ en
NAD+.
On qualifie souvent la fermentation du nom du compos organique rduit.

Cas de la fermentation lactique : c'est le pyruvate qui est l'accepteur d'lectrons
provenant du NADH,H+ qui est roxyd en NAD+ et le pyruvate est rduit en
lactate.

Cas de la fermentation alcoolique : le pyruvate perd une molcule de CO
2
pour
donner un actaldhyde. C'est ce dernier qui est l'accepteur d'lectrons
provenant du NADH,H+ qui est roxyd en NAD+ et l'actaldhyde est rduit en
thanol.











Illustration :


Escherichia coli par exemple, possde plusieurs types de chanes de transport
d'lectrons membranaires qui fonctionnent soit en parallle, soit en fonction des
conditions de culture. Escherichia coli est capable de raliser plusieurs types de
respirations :

Respiration arobie : lorsque la chane est couple l'O
2
, fonctionnelle en
arobiose
Respiration nitrate : lorsque la chane est couple au NO
3
-
, fonctionnelle en
anarobiose sur milieux nitrats
Respiration fumarate : lorsque la chane est couple au fumarate, fonctionnelle
en anarobiose sur milieu fumarate

Escherichia coli peut galement raliser des fermentations (roxydation des
coenzymes rduits dans le cytoplasme).








Diffrents tats d'oxydation des macrolments

tat d'oxydation
le carbone le plus rduit
CH
4
mthane -4
C
6
H
12
O
6
glucose -4
CO monoxyde de carbone -2
CO
2
dioxyde de carbone +4
HCO
3
-
hydrognocarbonate +4
le plus oxyd



l'azote
le plus rduit
NH
3
ammoniac

-3
N
2
azote

0
N
2
O oxyde nitreux

+1
NO oxyde nitrique

+2
NO
2
-
nitrite

+3
NO
3
-
nitrate

+5 le plus oxyd




le souffre le plus rduit
S
2-
sulfure -2
S souffre 0
S
2
O
3
2-
thiosulfate +2
SO
3
2-
sulfite +4
SO
4
2-
sulfate +6 le plus oxyd


Effet de l'oxygne : dtermination du type respiratoire des microorganismes

1 - Les bactries arobies strictes ne se dveloppent qu'en prsence d'air. Leur source principale d'nergie est
la respiration. L'oxygne molculaire, ultime accepteur d'lectron, est rduit en eau (Pseudomonas, Acinetobacter,
Neisseria).

2 - Les bactries microarophiles se dveloppent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle
d'oxygne est infrieure celle de l'air (Campylobacter, Mycobacteriaceae).

3 - Les bactries aro-anarobies facultatives se dveloppent avec ou sans air. C'est le cas de la majorit des
bactries rencontres en pathologie mdicale : les entrobactries (Escherichia, Salmonella), les streptocoques,
les staphylocoques. L'nergie provient de l'oxydation des substrats et de la voie fermentaire.

4 - Les bactries anarobies strictes ne se dveloppent qu'en absence totale ou presque d'oxygne qui est le
plus souvent toxique. Ces bactries doivent se cultiver sous atmosphre rductrice. La totalit de l'nergie est
produite par fermentation.

3.5 Conditions physico-chimiques de croissance

Effet du pH

Le pH (concentration en ion hydrogne [H+]) de l'environnement varie entre 0,5 (sols acides) et
10,5 (eaux alcalines des lacs).

Les bactries pathognes ou lies l'cosystme humain se dveloppent le plus souvent dans
des milieux neutres ou lgrement alcalins.
On considre que la valeur de 4.5 pour le pH est une limite la croissance des bactries
pathognes. Lacidification est un procd de stabilisation des aliments.

On distingue les bactries :

- neutrophiles qui se dveloppent pour des pH sont compris entre 5,5 et 8,5 avec un optimum
voisin de 7. La plupart des bactries pathogbes ou daltration sont neutrophiles

- alcalophiles qui prfrent les pH alcalins: cas de Pseudomonas et Vibrio, donc milieux de
culture particuliers

- acidophiles qui se multiplient mieux dans des milieux acides : cas des Lactobacillus


Remarque : les levures et les moississures sont capables de croitre dans des limites de pH de
10 2.


Effet de lactivit de leau Aw:

La disponibilit de l'eau prsente dans l'atmosphre ou dans une substance intervient
dans la croissance bactrienne. L'activit de l'eau (Aw) est inversement proportionnelle la pression
osmotique d'un compos. Ainsi, elle est affecte par la prsence plus ou moins importante de sels ou
de sucres dissous dans l'eau.

- Prsence de sels : Les bactries halophiles ncessitent du sel (NaCl) pour leur croissance. Cette
concentration peut varier de 1-6% pour les faiblement halophiles jusque 15-30% pour les bactries
halophiles extrmes (Halobacterium).

Les bactries halotolrantes acceptent des concentrations modres de sels mais non obligatoires
pour leur croissance (Ex. : Staphylococcus aureus).

- Prsence de sucres : Les bactries osmophiles ncessitent des sucres pour leur croissance.
Celles osmotolrantes acceptent des concentrations modres de sucres mais non obligatoires
pour leur croissance. Enfin les bactries xrophiles peuvent se multiplier en l'absence d'eau dans
leur environnement.

Remarques :
-la grande majorit des flores dalration des aliments sont sensibles law et la pression
osmophile. Les teneurs en sels importantes bloquent la croissance de ces bacteries
- les levures et les moisissures sont halotolrantes et osmophiles



Les bactries peuvent tre classes selon leur
temprature optimale de croissance.

- Bactries msophiles (Ex. : Escherichia coli) :
temprature de croissance proche de celle du corps
humain (37C)

- Bactries thermophiles (Ex. : Thermus aquaticus) :
tempratures de croissance comprises entre 45C et
70C .

- Bactries hyperthermophiles (Ex. : Archaea) :
tempratures de croissance suprieures 80C .

- Bactries psychrophiles (Ex. : ) :Tempratures
proches de 0C (optimum 10-15C).

- Bactries psychrotrophes (Ex. : Pseudomonas) :
tempratures de croissance proches de 0C avec
optimum de croissance proche des bactries
msophiles.


Remarque :les tempratures ngatives autorisent la
survie des bactries. Les collections de micro-
organismes sont conserves au rfrigrateur, au
conglateur a 80c ou 160C.

Effet de la temprature
Effets de diffrents composs chimiques : application aux milieux de culture
4. Cl dichotomique des principaux
groupes de bactries impliques
dans les IAA

CLE DICHOTOMIQUE : les principales familles bactriennes chimioorganohtrotrophes
GRAM FORME ENZYME FAMILLE TYPE RESPI. GENRE
catalase + Bacillaceae a.s ou a.an Bacillus
sporul
catalase - Bacillaceae an.s Clostridium
bacille
catalase + Actinobactries a.an Corynebacterium, Mycobacterium, Listeria
asporul
catalase - Lactobacillaceae a.an Lactobacillus, Bifidobacterium
Gram + Bacilles lactiques
a.s Micrococcus
catalase + Micrococcaceae
a.an Staphylococcus
coque
catalase - Streptococcaceae a.an Streptococcus, Enterococcus
Coques lactiques Leuconostoc, Lactococcus
COLIFORMES Escherichia, Klebsiella
+ Citrobacter, Enterobacter
oxydase - Enterobacteriaceae a.an lactose
- Salmonella, Shigella, Yersinia
Proteus, Serratia,
bacille
Pseudomonadaceae a.s Pseudomonas
oxydase + non class a.s Alcaligenes
Gram -
Vibrionceae a.an Vibrio, Aeromonas,
Autres Brucella, Legionella
coque oxydase + Neisseriaceae a.s Neisseria, Branhamella
Type respiratoire : a.s : arobie stricte
an.s : anarobie stricte
a.an : aro-anarobie