BIOSINTESE DA ESCOPOLETINA E ESCOPOLINA EM

MANDIOCA NA DETERIORAO FISIOLGICA PS

COLHEITA: ISOMERIZAO E-Z
Diciplina: Quimica dos Produtos Naturais
Prof Beatriz Helena L.N.S. Maia
Alunos: Inaiara Casapula e Joares Fabiano
Universidade Federal do Paran
INTRODUO
Nome cientifico: Manihot esculenta Crantz
Famlia:Euphorbiaceae
Gnero:Manihot
Espcie:M. esculenta

Nome popular: No Brasil, possui muitos nomes, usados em diferentes
regies, tais como: mandioca-brava - a que contm o venenoso cido
ciandrico - aipim, castelinha, macaxeira, maniva, maniveira, po-de-
pobre,e variedades como aiapu e caiabana, ou nomes que designam
apenas a raiz, como caarina.
Importante fonte de alimentao nos paises da America do Sul

INTRODUO
Embora a mandioca relativamente fcil de crescer, mesmo
em mau solos e sob condies de seca . suas razes tm um
tempo de vida curto de apenas um a trs dias , devido
DETERIORIZAO fisiolgicas ,que pode trazer um
desperdcio significativo e e perda econmica.

INTRODUO
Hidroxicumarinas desempenham o papel de defesa da planta contra
microrganismos .
As Cumarinas so lactonas do cido o-hidroxi-cinmico.
So amplamente distribudos nos vegetais, como:
Guaco
Castanha da ndia, (muito utilizada contra varizes),
Emburana,
Agrio,
Cumaru
Canela,
Entre outras, e em frutas como morango, cereja e damasco.

INTRODUO
Possuem um odor forte e caracterstico de baunilha, sendo amplamente
utilizadas como aromatizantes de produtos industrializados e como
fixadores de perfumes.
Apresentam atividade antibitica, broncodilatadora, fungicida,
anticoagulante, vasodilatadora, espasmoltica e antitrombtica.

A cumarina tem sido usada tambm como aromatizante de fumos e
algumas bebidas alcolicas, embora seja proibido o seu uso
como flavorizante de alimentos, em razo de sua possvel hepatotoxicidade.

INTRODUO
Os autores analisaram artigos para investigarem se o processo de
isomerizao era fotoqumico ou enzimtico, em diferentes plantas.
Esta reviso da literatura revelou vises conflitantes sobre o EZ-
mecanismo de isomerizao em cumarina a biossntese varia de uma
espcie para outra , mas a fase de isomerizao no foi relatado
anteriormente para escopoletina e escopolina na biossntese de
mandioca ou de outras plantas.
INTRODUO
Nesse estudo sobre as razes de mandioca , os autores propem que
a isomerizao em escopoletina e escopolina a biossntese
fotoqumica , deve ser biosintetizadas escopoletina - d
4
e escopolina -
d
4
em razes de mandioca durante PPD quando alimentados com
cido E- cinmico - d
7
. se a isomerizao enzimtico , escopoletina
- d
4
e a escopolina - d
4
, ou escopoletina - d
3
e scopolin - d
3
poderia
ser biosintetizadas dependendo sobre o mecanismo da enzima . Esta
perda especfica de um proton no foi discutida antes na biossntese
de quaisquer cumarinas nem de mandioca , nem em outras plantas.

ISOMERIA E-Z
E vem do alemo entgegen -> opostos
Z vem do alemo zusammen -> juntos




ISOMERIZAO DO CIDO O-CUMRICO EM BROTOS M.
OFFICINALIS
Reao catalisada pela luz
MATERIAIS E MTODOS
Tubrculos razes de diferentes cultivares ( MCOL 22 , MNGA 19 , MNGA 2
) foram colhidas a partir de plantas de mandioca que crescem no vidro
tropical casa na Universidade de Bath com a seguinte condio: 22-28 C,
umidade relativa (UR ) ( 40-80% ) e um perodo de luz 14 h por dia

Os padres foram obtidos a partir da rota Sigma -Aldrich Chemical Co. Ltd ,
Reino Unido. E- cinmico , cido 2 ,3,4,5,6 - d
5
foi obtido a partir de CDN
Istopos , Canad.


MATERIAIS E MTODOS
As analises em HPLC foram obtidas em um equipamento com sistema de
equipado com bomba (Jasco PU 980) e monitorado a 360 nm com um
detector de UV Jasco - 975 , utilizando 16 % de acetonitrila e 84% gua
contendo cido frmico a 0,1 % , velocidade de 4 mL / min de fluxo a 20 C.
Os cromatogramas foram obtidos registados num Goerz Metrawatt
Servogor 120 gravador . Colunas de HPLC foram adquiridos a partir de
Phenomenex Inc. : Fenomenex Gmeos 10 l C18 110A 250mm 10 com
guarda coluna Phenomenex Gmeos 5 l C18 1010 mm

MATERIAIS E MTODOS
HR EM ESI foi realizada num equipamento da Bruker espectrmetro de
massa micrOTOF no departamento de Farmcia e Farmacologia da
Universidade de Bath ou em um Micromass Quattro II em EPSRC Centro
Nacional de Espectrometria de Massa Service, Universidade de Pas de
Gales, Swansea. Os espectros de RMN foram obtidos num Varian Mercury
Espectrmetro a 400 MHz (
1
H ) e 100 MHz (
13
C ) em CD3OD , todos os
desvios qumicos so referidos em partes por milho ( ppm) relativamente
ao tetrametilsilano interno , e as constantes de acoplamento ( J) so
absolutos Os valores em Hz .


MATERIAIS E MTODOS - EXTRAO E PURIFICAO DE
ESCOPOLINA E ESCOPOLETINA
270g de raizes cortadas do 3 dia -
macerados com 200 ml de EtOH
Analisada por TLC
CHCl3 : EtOAc : MeOH
a 02:02:01 , visualizado
por UV a 365 nm
Razes de mandioca (1,3 kg, diversas cultivares ) foram descascados ( 1,1 kg) e , em
seguida, cortado em cubos de aproximadamente 1 cm3 , permitiu a deteriorar-se para
at 6 dias sob condies controladas ( 20 C, 80-90 % H.R. ) at triturao e extrao.


MATERIAIS E MTODOS EXTRAO E PURIFICAO DE
ESCOPOLINA E ESCOPOLETINA
Os extratos
MeOH foram
combinados
Filtrados e
evaporados
baixa presso
35-40 C
Resduo
Fracionado em
CHCl
3

Extrao por
SPE
MATERIAIS E MTODOS EXTRAO E PURIFICAO DE
ESCOPOLINA E ESCOPOLETINA
SPE
Eluente
Concentrado.
Analisado e idntico ao
comercial
Resduo
Dissolvido em MeOH-
purificado via HPLC
Identificao da
Escopoletina (4mg)
MATERIAIS E MTODOS EXTRAO E PURIFICAO DE
ESCOPOLINA E ESCOPOLETINA
Uma soluo
aquosa
concentrada7,6g
Separado e
coletado via
HPLC
Concentrado e
dissolvido
Identificado Via
RMN
1
H como
escopolina
(7mg)
MATERIAIS E MTODOS ALIMENTAO COM CIDO E-
CINMICO- D
7

1,2 Kg de Raizes
descascadas e
alimentados com 150mg
de cido E- cinmico D
7
,
( 2,3,2,3,4,5,6)
Dissolvidos em
10 ml de uma
soluo aquosa
de 4% Na
2
CO
3

Uma amostra
representativa
de um extrato
combinado
EtOH(32,9g)
Purificao via HPLC
Identificao RNM e HR-MS da
Escopolina e Escopoletina
MATERIAIS E MTODOS ALIMENTAO COM CIDO E-
CINMICO- D
6

1,2 Kg de Raizes descascadas e 195g foram
alimentados com 30mg de cido E- cinmico D
7
, (
2,3,2,3,4,5,6) , dissolvidos em 3 ml de uma soluo
aquosa de 4% Na
2
CO
3

Uma amostra
representativa
de um extrato
combinado
EtOH(4g)
Purificao via HPLC
Identificao RNM e HR-MS da
Escopolina e Escopoletina
MATERIAIS E MTODOS ALIMENTAO COM CIDOS E-
CINMICO- D
N

640g de Raizes descascadas e separadas em 4 grupos
de 85g foram alimentados com 20mg de cada cido
* cido E- cinmico D
7
, ( 2,3,2,3,4,5,6) ,
*cido E- cinmico -2-D
1
,
* cido E- cinmico D
5
, ( 2,3,4,5,6)
* cido E- cinmico -3- D
6
, ( 2,3,4,5,6) , ,
dissolvidos em 3 ml de uma soluo aquosa de 4% Na
2
CO
3

Uma amostra
representativa
de um extrato
combinado
EtOH(2g)
Purificao via HPLC
Identificao RNM e HR-MS da Escopolina
e Escopoletina
MATERIAIS E MTODOS ALIMENTAO COM CIDO E- CINMICO
D7 , ( 2,3,2,3,4,5,6) EM LUZ E ESCURO

690g de Raizes descascadas e
separadas em 2 grupos de 85g foram
alimentados com 20mg de cido E-
cinmico D
7
, ( 2,3,2,3,4,5,6)
dissolvidos em 2,3 ml de uma soluo
aquosa de 4% Na
2
CO
3

Uma amostra
representativa
de um extrato
combinado
EtOH(2g)
Purificao via HPLC
Identificao RNM e HR-MS da Escopolina e
Escopoletina
MATERIAIS E MTODOS ALIMENTAO COM CIDO E-
CINMICO D7 , ( 2,3,2,3,4,5,6) EM LUZ E ESCURO
690g de Raizes descascadas e
separadas em 2 grupos de 85g foram
alimentados com 20mg de cido E-
cinmico D
7
, ( 2,3,2,3,4,5,6)
dissolvidos em 2,3 ml de uma soluo
aquosa de 4% Na
2
CO
3

Claro
Purificao
HPLC
Escuro
Purificao
HPLC
ESTRUTURA BASICA DE CUMARINAS
RESULTADOS E DISCUSSO
Sntese do cido E-cinmico 2- d
1
.


RESULTADOS E DISCUSSO
Uma experincia preliminar foi realizado alimentando raiz de mandioca em
cubos com deutrio rotulado cido E- cinmico -D
7
, para determinar o nvel
de incorporao de rtulo observada sob estas condies simples , a fim de
investigar os intermedirios ao longo da via biossinttica hidroxicumarina .

RESULTADOS E DISCUSSO
No entanto , o intrigante resultado que escopoletina - D
3
e os seus O-
glicosdeo escopolina - d
3
. Foram obtidos e no o ( esperado )
correspondente anlogos d
4
nos levou a investigar o estgio de
isomerizao em detalhe .
RESULTADOS E DISCUSSO
HR EM ESI espectros revelou a presena dos picos de abundncia natural
de escopolina e escopoletina , alm de picos escopolina - d
3
e escopoletina
- d
3
.
No houve MS picos correspondentes a escopolina-d
4
ou escopoletina -d
4

que espervamos a partir da experincia de alimentao de cido E-
cinmico - d7.
Este perda de um tomo de deutrio mais do que o esperado pelos
pesquisadores durante a biossntese,.
Requer uma reconsiderao dos mecanismos ao longo do caminho . A fim
de determinar qual o tomo de deutrio adicional tinha sido perdido
Uma outra experincia de alimentao foi realizada usando E- cinmico ,
cido 3 ,2,3,4,5,6 - d,
6
isto , com istopo
1
H em C- 2 . este beneficia
dos mesmos dois produtos.
RESULTADOS E DISCUSSO
A fim de investigar a biossntese de escopoletina e escopolina durante PPD
, um experimento de alimentao foi desenvolvido . recentemente razes de
mandioca colhidas foram alimentados com diferentes deuterado E- cinmico
intermedirios de cido , com um pH 7.5 ajustado para ser compatvel com
o estado fisiolgico das razes . Uma amostra autntica comercial de
escopoletina foi utilizado para identificar o seu pico HPLC nos extratos de
raiz , no entanto , escopolina no est comercialmente disponvel .
Identificados por RMN E HR EM, e a escopolina foram utilizados uma
amostra de referencia.

ROTA DAS CUMARINAS
HIDROXILAO DO CIDO CINMICO
ROTA DA CUMARINA
ROTA DO ESCAPOLETINA A PARTIR DO CIDO CINMICO
RESULTADOS E DISCUSSO ALIMENTAO COM CIDO
CINMICO D
N



RESULTADOS E DISCUSSO - ALIMENTAO COM CIDO
CINMICO D
N



RESULTADOS E DISCUSSO






Os resultados obtidos, confirmam que o EZ- isomerizao da C = C
ligao dupla na biossntese de escopoletina e escopolina em razes
de mandioca durante PPD envolve a troca especfica do tomo de
hidrognio na posio 2 do cido E- cinmico e, portanto, susceptvel
de ser catalisada por enzima.
. Se esta isomerizao biossinttica passo ao longo do caminho de
escopoletina foi um no enzimtica reao fotoqumica , que seria
de esperar para proceder atravs de um diradical decorrente pela luz
mediada fisso homoltica (para p * excitao) , rotao de r -bond do
diradical que ento fecha a ligao C = C dupla , para se obter o
ismero-Z

RESULTADOS E DISCUSSO






Portanto , h haveria a perda de C - 2 de deutrio ( ou prton )
durante o isomerizao fotoqumica de E- cinmico cido - d7 que
faria ser convertido em escopoletina - d4 e este no foi observado .
alimentao experimentos com E- cinmico cido -D7 em luz ou em
condies de pouca luz Por conseguinte, foram realizados para
determinar se ou no o enzimtica reao de luz necessria .

RESULTADOS E DISCUSSO






O resultado esperado de alimentar cido E-cinmico-D
7
escopoletina-d
4
.

Em mandioca sob PPD, os resultados reais de experimentos de alimentao
com cido E-cinmico- d
7
2,3,2,3,4,5,6- e cido E-cinmico-3,2,3,4,5,6-
d
6
so de que ambos os precursores deu escopoletina-d
3
.

Os resultados experimentais de alimentao E-cinmico- cido 2,3,4,5,6-d
5

e cido E-cinmico-2-d
1
mostra os padres de marcao isotpica de
escopoletina escopoletina-d
2.

RESULTADOS E DISCUSSO


Para confirmar a perda do prton de deutrio a partir do C-2, os autores
decidiram alimentar os cubos com o istopo de deutrio localizados em C-
2.
Sntese do cido E-cinmico-2-d
1
, e confirmaram a sntese por RMN
13
C
Alimentaram os cubos com o E-cinmico-2-d
1
, e
RESULTADOS E DISCUSSO


RESULTADOS E DISCUSSO


Alternativamente , uma adio nucleoflica de gua atravs o C = C
dupla ligao pode ocorrer , para se obter o b - hidroxicido , como
em o segundo passo da b - oxidao bem conhecido dos gordos
saturados cidos , seguido de rotao r - ligao e de eliminao de
gua para efeitos a isomerizao .
RESULTADOS E DISCUSSO


Na fermentao de trevo doce (M. alba) , ataque microbiano em cido o-
cumrico leva a 4 hydroxicoumarina e, finalmente, para o dicumarol (a
partir de uma reaco de aldol cruzado com formaldedo microbiana ) (
Bellis et al , 1967; . Bye e King, 1970) ea histria varfarina bem conhecido
(Last , 2002). Tal uma reaco levaria a uma perda de H ( ou D ) a partir da
posio C-3 do cido cinmico e, portanto, ns no consideramos
microrganismos para estar envolvido na biossntese de cumarina em
mandioca . A gua igualmente adicionada ao cido E- cinmico , durante
a primeira etapa de benzaldedo , vanilina , benzico , saliclico e cido
biossntese vanilloic ; enoil - SCoA hidratase em plantas e bactrias,
catalisa a adio de gua, atravs da ligao dupla de um a , b
insaturado tiol-ster ( por exemplo, cinamol SCoA ou feruloil SCoA ) (
Gasson et al . , 1998; Abd El - Mawla e Beerhues , 2002; . Bahnson et al ,
2002; Walton et ai . , 2003) .
RESULTADOS E DISCUSSO


O intermedirio a partir de um tal nucleoflico. Adicionalmente na
posio b poderia sofrer rotao r - ligao e , em seguida,
antiperiplanar - ( b - ) eliminao conduzindo formao do
geomtrica ismero . Conclumos, portanto, que, como escopoletina
- d3 e scopolin - d3 ( no d4) foram biosintetizadas quando cubos de
mandioca foram alimentados com E- cido cinmico - d7 , e como j
estabelecido que a isomerizao fase da sua biossntese em razes
de mandioca durante PPD no fotoqumica , mas sim enzimtica ,
que pode ser catalisada por uma isomerase que no dependente
da luz .
CONCLUSO


Os autores estabeleceram atravs dos procedimentos e anlises que
a isomerizao fase da sua biossntese em razes de mandioca
durante PPD no fotoqumica , mas sim enzimtica , que pode ser
catalisada por uma isomerase que no dependente da luz .
BIBLIOGRAFIA


Soad A.L. Bayoumi a, Michael G. Rowan a, Ian S. Blagbrough a,
John R. Beeching. Biosynthesis of scopoletin and scopolin in
cassava roots during post-harvest physiological deterioration: The E-
Z-isomerisation stage. Journal Phitochemistry, 69, 2008 , 2928-2936.