Deteccin molecular del gen A de la lipasa en Bacillus subtilis de

cepas aisladas del suelo

Hamid Mir Mohammad Sadeghi, Mohammad Rabbani, Fatemeh Moazen, Sareh Homami
BIOLOGIA MOLECULAR
INTRODUCCION
Hoy en da hay un aumento de la demanda industrial de enzimas producidas por
microorganismos. Entre ellas se encuentran las lipasas, que catalizan la hidrlisis de steres de
glicerol, tales como las lipasas y esterasas que rompen acilgliceroles largos o cortos de cidos
grasos y glicerol, respectivamente. Las lipasas del B. subtilis es una de las lipasas ms
pequeas informada y debido a sus caractersticas nicas tiene aplicaciones comerciales y de
investigacin, por ejemplo, el gen A de la lipasa de B. subtilis puede expresarse en su forma
activa en Escherichia coli y sin la necesidad de co-expresar cualquier chaperone especfico.
OBJETIVO
La deteccin de microorganismos en el suelo de las zonas, que tienen condiciones extremas,
como climas muy calientes puede conducir al aislamiento de enzimas altamente tiles.
El objetivo de este estudio es la deteccin y creacin de una tcnica rpida y fiable para la
identificacin de muestras de suelo de cepas de Bacillus que contienen lipasa.

MATERIALES
Muestras de suelo
Cajas de Petri
Caja para electroforesis
KIT high pure template
Micropipetas
Termmetros
Agar nutritivo
Incubadoras
Gel de agarosa

MTODOS BIOQUMICO
Se recogieron y se secaron las
muestras de suelo de las diferentes
reas de Isfahan en Irn que
incluyen los ros, jardines y tierras
de cultivo a temperatura ambiente
durante 48 h.
Posteriormente, diferentes
diluciones de estas muestras se
sembraron en placas de agar
nutritivo (se incubaron durante 24
horas a 37 C) y se obtuvieron
colonias bacterianas.
A partir de estas colonias, los que
presentan la morfologa de las
colonias de B. subtilis se separaron,
se sembr en placas de agar
nutritivo y se incubaron a 37 C
durante 24-48 h.
Para los experimentos bioqumicos y
moleculares, B. subtilis PTCC 1254
y Bacillus licheniformis PTCC 1331
obtenido a partir de The Persian
Type Culture Collection se utilizaron
como controles positivos y
negativos, respectivamente.
Las pruebas bioqumicas para la
deteccin de cepas de B. subtilis se
realizaron de acuerdo a los
procedimientos reportados por Mc
Fadden , que incluye pruebas para
catalasa, lecitinasa, nitrato, Voges-
Proskauer (VP), citrato y maltosa.
MTODOS MOLECULARES
Extraccin de ADN de las colonias escogidas se realiz utilizando el KIT high pure template.
Los cebadores se disearon de acuerdo con las dos regiones conservadas del gen A de lipasa de
B. subtilis (adelante: 5'-ATGGTTCACGGTATTGGAGG-3 'y revertir: 5'-
CTGCTGTAAATGGATGTGTA-3'). Se realizo la reaccin en cadena de la polimerasa y los
productos obtenidos se sometieron a electroforesis en 0.7% (w / v) en gel de agarosa.
PCR
OBJETIVO: Obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN
particular, partiendo de un mnimo

FUNCIN: Amplificar un fragmento de ADN, de una forma especfica.

Gel de agarosa teido con bromuro de etilo que
muestra varios productos de PCR obtenidos mediante
distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad
Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR
convencional.

1. ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

2. Desoxinucletidos trifosfato (sustrato para polimerizar nuevo ADN).

3. Dos cebadores (primers).

4. ADN polimerasa con temperatura ptima alrededor de 70C (Taq polimerasa).

5. Cofactores de la polimerasa (Iones divalentes y monovalentes).

6. Solucin tapn para mantener el pH ptimo de la ADN polimerasa.

7. Termociclador, que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas de
ciclo.
QUE SE NECESITA PARA QUE SE LLEVE ACABO LA
PCR?
Basado de la secuencia del gen A de lipasa de B. subtilis, el producto de PCR debe ser de
aproximadamente 371 pb. Posteriormente de los productos amplificaados se realizo la tcnica de
polimorfismo de conformacin de cadena simple (SSCP).
POLIMORFISMO DE CONFORMACIN DE
CADENA SENCILLA (SSCP)
La tcnica SSCP esta basada en la migracin de las cadenas simples (hebras monocatenarias) de una
secuencia de ADN en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Las muestras se desnaturalizan a altas
temperaturas (95C) y luego el gel migra a bajas temperaturas para evitar que las cadenas de ADN
vuelvan a unirse. Segn la conformacin espacial que las cadenas adopten, y esto depende enteramente
de la secuencia nucleotdica del fragmento, las muestras de ADN analizadas presentarn distintos
patrones de bandas.
RESULTADOS
Los resultados de las pruebas bioqumicas realizadas en 15 colonias se muestran en la Tabla 1.
Las muestras identificadas como putativo de la B. subtilis fueron: la 3, 6, 8 y 13.
RESULTADOS
Figura 1. Amplificacin por PCR de los B. subtilis En
este experimento los moldes de ADN utilizados fueron
los siguientes: carriles 1 y 2 son los controles positivo y
negativo, y los carriles 3-6 son putativo B. subtilis de
las cepas aisladas de suelo iran correspondiente a las
muestras 3,6,8, y 13 en la Tabla 1. respectivamente.
RESULTADOS

Figura 2. Optimizacin de la concentracin de MgCl2 para la
deteccin de B. subtilis se usaron concentraciones de : 1 -, 1.5-,
2 -, 2.5-y 3 mM correspondiente a los carriles 1-5,
respectivamente. Con una temperatura de 55 C.
RESULTADOS
Figura 3. Efecto de diferentes temperaturas en la amplificacin
por PCR con las concentraciones de 1,5-, 2 -, 2,5-y 3 mM y
temperaturas de 58,3 (carriles 1-4, respectivamente) y 64 C
(carriles 5-8, respectivamente).
La Figura 4. La electroforesis de productos de PCR bajo las
condiciones de optimizacin (MgCl2 2,5 mM y una temperatura
de hibridacin de 55 C). Mostr que la cantidad de ADN
amplificado para todas las muestras aument en comparacin
con los experimentos anteriores.
RESULTADOS
RESULTADOS
Figura 5. . Los resultados de SSCP se muestran a continuacin, los patrones de las
bandas obtenidas para las muestras 3 y 8 eran similares entre s. A diferencia de la
muestra 13 y el control que mostraron el mismo patrn (carriles 4 y 5), pero eran
diferentes a las muestras de 3, 6 y 8 (calles 1-3, respectivamente).
BIBLIOGRAFA
Acharya P, Rajakumar AE, Sankaranarayanan R, RaomNM (2004). Structural basis of selection and
thermostability of laboratory evolved Bacillus subtilis lipase. J Mol Biol. 341: 1271-1281. Brockerhoff H and
Jensen RG (1974). Lipolytic Enzymes. Academic Press, New York.
Molecular detection of lipase A gene in putative Bacillus subtilis strains isolated from soil Hamid Mir
Mohammad Sadeghi, Mohammad Rabbani, Fatemeh Moazen1, Sareh Homami1. Department of
Biotechnology and Isfahan Pharmaceutical Research Center, School of Pharmacy, Isfahan University of
Medical Sciences, Isfahan, I.R. Iran 2Applied Physiology Research Center, Isfahan University of Medical
Sciences, Isfahan, I.R. Iran