Your Logo

ASPECTOS BASICOS
GENTICOS, CLULARES Y
QUMICOS IMPORTANTES EN
LA MUTAGENESIS.
Viviana Cardona Pemberthy
Contenido
Conceptos bsicos.
Tipos de mutacin.
Manejo de lneas celulares: Equipos y material
Caractersticas de la lnea celular seleccionada.
Ensayos de deteccin y pruebas para evaluacin
de diferentes parmetros.
Evaluacin y proceso de resultados.


Conceptos
Genotxico
Mutgenos
Micro mutaciones
Macro mutaciones
Agente Clastgeno
Agente aneunogeno
Conceptos
Genotxico
Carcingeno
Transformacin
celular de tipo
irreversible
Iniciacin
Promocin
Progresin
90-95% 1-5% 1-2%
A. Qumicos
A. Fsicos
A. Biolgicos
Conceptos
Dao inducido en el
desarrollo ( gestacin)
Talidomida
Radioactividad
Genotxico
Teratgenos
Conceptos
Mutacin
Somtica Germinal
Gnica
Cromosmica Genmica
Espontanea
Inducida
Errores en la replicacin
Lesin fortuita en el ADN
Movilizacin de elementos
gnicos transponibles

Anlogo de Bases
Agentes alquilantes
Agentes intercalants
Mutgenos biolgicos
Estructura del ADN
Tipos de mutacin
Mutaciones Espontaneas
Errores durante la replicacin
Lesiones o daos fortuitos en el ADN
Los elementos genticos transponibles
Tipos de mutacin
Mutaciones Inducidas
Anlogos de bases nitrogenadas
Agentes alquilantes
Radiaciones Ionizantes
Radiaciones No Ionizantes
Agentes qumicos
Agentes Biolgicos
Alteracin en la estructura del ADN
Tipos de mutacin
Mutaciones gnicas o moleculares
No sinnimas
Sinnimas o
silenciosas
Neutras
Alteran la secuencia de nucletidos
Sustitucin de
AA en la
protena
resultante
Fuera del sitio
activo de la
protena ( no
codifica )
AA insertado es
distinto pero posee
propiedades
similares
Sustitucin de bases
Transiciones
Transversiones
Corrimiento estructural
Sitios de corte y empalme
Tipos de mutacin
Mutaciones gnicas o moleculares
Tipos de mutacin
Mutaciones cromosmicas
Reordenamiento cromosmico
Cambios en la
estructura de los
cromosomas
Duplicacin o supresin de
genes o de segmentos de
un cromosoma,
reordenamiento del material
gentico dentro del
cromosoma.
Duplicacin
Delecin
Inversin
Translocacin
Tipos de mutacin
Mutaciones cromosmicas
Tipos de mutacin
Mutaciones genmicas o numricas
Afectan el nmero de
cromosomas o todo el
complemento genmico
Poliploides
Conjuntos
adicionales de
cromosomas
Monosomas
Trisomas
Tetrasomas
Autopoliplodes
Alopoliploides
Aneuploidas
Aumento o
disminucin en el
nmero de
cromosomas
Haploidias
Provocan una
disminucin en el
nmero de juegos
de cromosomas
Tipos de mutacin
Mutaciones genmicas o numricas
Equipo en laboratorio
Equipo en laboratorio
Tomado de Freshney R.
A manual of basic thechnique and Specialized application
Material estril
Cmara de flujo
Equipo en laboratorio
Microscopio invertido
Centrifugas
Lnea celular K562
Leucemia mieloide crnica.
RPMI
NBSC min 5% ( mantenimiento)
SBF 10% ( experimentos).
Cambio max 4 das.
Doubling time aprox 24 horas.
Condiciones de incubacin
tradicionales.
Medio bsico ( pH 7.2).


Lnea celular 293T
Cncer de seno.
DMEN.
SBF 10%
altamente sensibles
Cambio a los 3 das.
No dejar despegar del T25.
Condiciones de incubacin
tradicional.
Medio pH 7.5



Lnea celular U937
Princecitas
Monocitos de pulmn.
RPMI+ 25 mM de Hepes.
SBF ( minimo10%)
L-glutamina ( 1% diferenciacin a
macrofagos- 0.5% se mantienen
como monocitos).
cambio max 3 das.
Doubling time aprox 21-22 horas.
Condiciones de incubacin
tradicionales.
Medio medianamente bsico ( pH
7.2).


Lnea celular CHO-K1
Ovario de Hanster Chino
Clulas de adhesin
RPMI, HANS 12,
Cambio de 4 o 5 das
NBSC (incluso 3%).
Doubling time 14 horas.
Medio bsico ( pH 7.5).
Doubling time aprox de 21
horas.
Incubacin tradicional/ sin CO
2






Manejo del cultivo
Cultivos In vitro
Clulas y caracteristicas
Crecimiento exponencial
Identificacin del doubling time y ciclo
celular.
Tratamientos y evaluacin dentro de la
fase exponencial.
No encaminadas a la diferenciacin.
Determinacin de viabilidad antes de
adicionar tratamientos ( superior
95%).
Clulas saludables ( morfologa).
Manejo de varios cultivos ( hora del
experimento)
Cambio mximo 3 das.
Cultivo subconfluente.

Identificacin del doubling time y Cell cycle time.

Doubling time
Periodo de tiempo donde la
poblacin celular es duplicada.
Cell cycle time
Periodo de tiempo donde las clulas
ubicadas en una fase hacen el ciclo
completo y vuelven a entrar en la
misma fase de donde partieron.

Determinacin de viabilidad antes de
adicionar tratamientos ( superior 95%).

Test de exclusin por azul de trypano (1:1).
Conteo de clulas muertas y de clulas vivas, con un posterior
tratamiento de datos terico, aplicando la formula.


Ensayos de deteccin y pruebas para evaluacin de
diferentes parmetros.

Bromuro de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol MTT
Test de exclusin azul de trypano.
Determinacin IC50.
Integridad Mitocondria (citometra).
Liberacin de Citocromo C
Activacin caspasas
Eficiencia de clonacin



Citometra para ciclo.
Funcin de acumulacin.
ndice mittico.

Ensayos de deteccin y pruebas para evaluacin de
diferentes parmetros.
Pruebas de micronucleos
Alteraciones cromosmicas
Test de cometa.
Test de Ames.
Intercambio de cromatidas
hermanas.
Ensayos de deteccin y pruebas para evaluacin de
diferentes parmetros.

Evaluacin y proceso de resultados.

El aumento en la respuesta relacionado con el control negativo es un
efecto genotxico significativo para las clulas?

Esta la respuesta relacionada con la concentracin.

En los resultados dbiles, es el efecto reproducible.

Es el resultado positivo consecuencia de alguna va especifica de
activacin metablica/ un metabolito especifico activo a nivel in vitro.

Puede ser el efecto atribuido a las condiciones extremas del cultivo in
vitro que no son reproducibles in vivo tales como pH extremo,
osmolalidad.


Evaluacin y proceso de resultados.

En el efecto se observan niveles de supervivencia extremadamente
bajos- niveles aceptables de toxicidad?

Es el resultado positivo atribuible a un contaminante (caso si el
compuesto no muestra alertas estructurales, es dbilmente
mutagnico o mutagnico solo a muy altas concentraciones.

Los resultados obtenidos para un genotxico extremo determinado
son similares a los resultados obtenidos para otro compuesto de la
misma clase qumica (Haworth, 1994).


Evaluacin y proceso de resultados.

Experimentos por triplicado.

Dos replicas como mnimo de cada experimento.

Se trabajan los promedios de las repeticiones y las replicas al
azar.

La graficas para resultados obtenidos por equipos como
citometras, HPLC, debe colocarse la mas representativa de los
resultados.

Datos deben ser procesados es paquete estadistico, SPSS,
STAT, bajo los parmetros de cada experimento.
Algunos estudios
Accin selectiva del cido ascrbico sobre la
muerte de clulas leucemoides.
Efecto del acido aristoloquia.
Efecto de compuestos extraidos de plantas
colombianas.
Efecto de pesticidas mas utilizados.


Algunos Estudios
Se determino el efecto del cido ascrbico en clulas
de leucemia.

Test de azul de trypano
Ensayo de MTT
Algunos estudios
Citometra para ciclo
Algunos estudios
Conclusiones
Las pruebas de genotoxicidad se utilizan tanto en
identificacin de blancos para clulas malignas,
como en identificacin de daos causados por
agentes qumicos.

El modelo in vitro es un modelo inicial adecuado
para un posterior manejo a nivel in vivo del agente
en estudio.

Conclusiones
Un manejo con la menor cantidad de variables
presentes en los experimentos, para identificar un
efecto sin ruido.

La genotoxicidad, la citotoxicidad, efecto citosttico
y la clastogenicidad, deberan ser parametros
determinados tambin en los efectos adversos de
los agentes qumicos a nivel humano







GRACIAS