DIGESTIN DE DNA

CON
ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCIN
OBJETIVO
Someter a una digestin el DNA plasmdico
(plsmido pEGFP-N1) con la enzima de restriccin
EcoR1, observando el efecto de dicha restrictasa en
la estructura de DNA por medio de una
electroforesis en gel de agarosa.

METODOLOGA
Buffer 10x 10L
EcoR1 0.5L
DNA 3.3L
Agua 5.2 cbp 10L
Clculo
1058.7ng DNA -----------1L
3500ng DNA-------------- x= 3.3059L



DNAt-----------1058.7ng/L
RNA-------------- 846.4 ng/L

RESULTADOS
Figura No. 1 Resultados de la electroforesis
en gel de agarosa al 1% del plsmido
pEGFPN1 de Escherichia coli (DHS)
obtenidos de los equipos pares, donde se
observa muy poco DNA plsmidico, pero si
una gran cantidad de RNA. Dnde: 1)
Marcador de 100 pb 2) Muestra de DNA
digerido por la enzima de restriccin EcoR1
3) muestra de DNA plsmidico sin digerir.
DISCUSIN
Las molculas de DNA plasmdico de una bacteria son circulares pero, al
igual que el cromosoma bacteriano, estn retorcidas debido a la enzima
GIRASA, que es una topoisomerasa de tipo II. Cuando dos regiones
bicatenarias de DNA se aproximan, la girasa puede aadir
superenrollamientos al DNA. Para hacer esto, corta ambas hebras de una
de las regiones del DNA, pasa la otra regin a travs de la brecha y une
de nuevo los extremos resultantes del corte anterior. Debido a que las
molculas superenrolladas son ms compactas, su volumen es menor, se
mueven con ms facilidad a travs del gel, y las encontramos ms lejos
del punto de origen. Las molculas circulares relajadas y las molculas
lineales de longitud completa avanzan ms lentamente que las
superenrolladas.
La banda ms cercana al punto de partida corresponde al DNA plsmidico
en su forma circular relajada, la segunda banda ms cercana al punto de
partida corresponde al DNA plsmidico digerido por la endonucleasa, es
decir su forma lineal y por ltimo la banda ms cercana del punto partida
corresponde al DNA plsmidico en la isoforma superenrrollada.
Mapa de restriccin del plsmido pEGFP-N1
resistente a kanamicina
Al usar una sola enzima de
restriccin se esper un solo
fragmento del plsmido que en
realidad solo fue la molcula
abierta. El plsmido usado,
pEGFPN1 de 4733 pb extrado
de la cepa Escherichia coli
DH5 que le confiere resistencia
a la Kanamicina, tiene una sola
zona de reconocimiento
(secuencia: GAATTC) para la
enzima de restriccin EcoR1
extrado de la cepa Escherichia
coli RY13 por lo tanto solo se le
hizo un corte a todo el plsmido
disponindolo en conformacin
lineal.

En la electroforesis la muestra se observ digerida y sin digerir, observndose
bandas solamente para RNA, interpretndose que, al no haber bandas en la zona
esperada, el DNA plsmidico se obtuvo en muy poca cantidad; la causa probable
de lo ocurrido es el tiempo del cultivo bacteriano, pues la tcnica miniprep
establece la recoleccin de la bacteria a las 16 horas de sembrada, justo en la
transicin de la fase logartmica a estacionaria, en la que el DNA se encuentra en
mayor cantidad que el RNA. Al usar un cultivo bacteriano que haya sobrepasado
las 16 horas se encuentra en la fase estacionaria, momento en el que el DNA se
compacta en el nucleoide y disminuye su metabolismo, encontrndose el RNA en
mayor cantidad.
CONCLUSIONES
Se realiz el aislamiento y purificacin del
plsmido pEGFP-N1 proveniente de la cepa
bacteriana Escherichia coli (DHS) mediante
el mtodo de mini prep, as como la digestin
del DNA plsmidico, utilizando la enzima de
restriccin EcoR1, pudindose observar
mediante electroforesis en gel de agarosa al
1%, la presencia del plsmido purificado, con
tres formas topolgicamente diferentes; la forma
superenrrollada, la forma circular relajada, as
como su forma lineal producto de la misma
digestin de DNA plsmidico.

ARTICUL
O
Demostrar que la cepa empleada en el producto cubano biolarvicida
Bactivec, presenta idntico patrn gentico al de la cepa de referencia
266 de Bacillus thuringiensis del Instituto Pushkin del antiguo
Leningrado y con ello aportar una herramienta ms para el control
decalidad del producto.

OBJETIV
O
MTODO
Se estudiaron 3 cepas 266 de Bacillusthuringiensis H-14

- Cepa No. 1 es la cepa 266 de referencia
- Cepa No. 2 es la cepa 266 extrada directamente del producto Lote del 2001
- Cepa No. 3 corresponde a la cepa 266 extrada directamente del producto Lote del
2002.

Se cultivaron las cepas en caldo soja/triptona por 18 h a 30 C, la masa bacilar fue
concentrada por centrifugacin y se procedi a la extraccin del ADN cromosomal
El ADN cromosomal de cada cepa fue digerido con las enzimas Hindlll y EcoRl, para ello
se realiz el ensayo siguiendo las recomendaciones del proveedor para cada enzima. La
electroforesis del producto se llev a cabo en gel de agarosa a 0.8% a 30V durante 16h, al
trmino de las cuales se fotografi el gel que contena los patrones de digestin obtenidos.
Si los organismos son genticamente iguales, el anlisis de restriccin permite obtener
patrones idnticos de fragmentos polimrficos del ADN, y para incrementar el rigor de
discriminacin, se recomienda la digestin con una segunda enzima, lo que ayuda a
confirmar la identidad de sus patrones.
ANALISIS
Con el empleo de las enzimas de restriccin HindIII y EcoRI se logr obtener la
digestin del ADN de las cepas estudiadas, con un nico patrn para cada enzima.
Estos resultados indican que las huellas genticas de las cepas aisladas del producto
se han mantenido y por otro lado estos patrones pueden ser utilizados como punto de
comparacin para estudios posteriores.
REFERENCIAS
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