ENZIMAS y CINTICA

ENZIMTICA
Enzimas
Son catalizadores biolgicos, que hacen que la
vida sea posible en condicionesd de
temperaturas moderadas y pH casi neutro
Todo catalizador acta:
- aumentando la velocidad de reaccin directa e
inversa
- haciendo que la reaccin alcance ms pronto el
equilibrio
Un catalizador no modifica el equilibrio, y las
propiedades termodinamicas de reaccin no
varan
Propiedades de las enzimas
Son, en su mayora de naturaleza proteica
Protenas globulares, relativamente grandes o
complejos proteicos
Sus principales caractersticas son:
Efectividad, son mucho ms efectivas que
cualquier catalizador biolgico
Especificidad: actan sobre un tipo de
reaccin(especificidad relativa) o sobre un
sustrato determinado (especificidad absoluta)
Se conocen actualmente molculas no
proteicas que actan como catalizadores
biolgicos: como ribozimas ( ARN cataltico)
abzimas ( anticuerpos con actividad cataltica)
No modifican los valores de las propiedades
termodinmicas: G, S, H y K de la
reaccin sobre la cual actan, pero cambian los
coeficientes cinticos y el mecanismo de la
reaccin
Cmo actan las enzimas
La presencia de una enzima hace que el mecanismo
de la reaccin correspondiente se modifique,
disminuyendo as la energa de activacin requerida
para que las molculas de reactivo se transformen en
productos
En consecuencia, las molculas necesitarn menor
energa de activacin, para transformarse en
productos
Al producirse la reaccin enzimtica el sustrato y la
enzima se unen para formar en complejo enzima
sustrato, liberandose posteriormente el producto de la
reaccin y regenerndose la enzima
Efecto sobre la energa de
activacin
Mecanismo de la reaccin
enzimtica
Clasificacin de las enzimas
La unin internacional de Bioqumica y Biologa
molecular (IUBMB) ha establecido una clasificacin
sistemtica basada en el tipo y mecanismo de la
reaccin. Todas las enzimas se clasifican en 6
clases_
Clase 1 Oxidorreductasas
Clase 2 Transferasas
Clase 3 Hidrolasas
Clase 4 : Liasas
Clase 5 Isomerasas
Clase 6 Ligasas
En cada clase, se distinguen subclases, y dentro de
cada subclase se se diferencian las subsubclases
Cada enzima se distingue por un nmero de 4
cifras, adems del nombre sistemtico
Por ejemplo
EC 2 7 1 1 es la ATP D-hexosa 6
fosfotransferasa
Estado estacionario
El concepto de estado estacionario es a
menudo empleado para estudiar sistemas
dinmicos.
En esta situacin la velocidad de formacin de
una sustancia es igual a la velocidad de
descomposicin, mantenindose la
concentracin de dicha sustancia constante. No
es un estado de equilibrio
En la cintica enzimtica, se aplica a las
concentraciones de los intermedios de reaccin
Estado pre-estacionario

Cuando se mezcla una enzima con un gran exceso de sustrato
hay un periodo inicial llamado estado pre-estacionario, en el
cual la concentracin de los intermediarios aumenta hasta
alcanzar la concentracin constante (estado estacionario
La medicin de las velocidades de reacciones enzimticas se
hacen generalmente en el estado estacionario, donde la
velocidad cambia muy poco con el tiempo. El estado
estacionario es una aproximacin, ya que durante la reaccin el
sustrato se va consumiendo, sin embargo como las mediciones
se hacen en un intervalo de tiempo corto, se puede considerar
que la concentracin de sustrato permanece prcticamente
constante.
El estudio del sistema en el estado pre-estacionario es
sumamente importante para el estudio de los mecanismos de
la catlisis.
Importancia de la cintica
enzimtica
El conocimiento de la cintica enzimtica es
importante para el bioqumico por varias
zones:
- La cintica,juntamente con otras tcnicas
provee informacin sobre el mecanismo de
accin de las enzimas
- Permite ver el rol de una enzima en las
condiciones de una clula viva y la respuesta
de la mismas frente a los cambios de
concentracin de metabolitos
- Ayuda a ver como la actividad de una enzima
puede ser controlada, y entender los
mecanismos de regulacin por enzimas
tnte
as
Datos cinticos
Par determinar la velocidad de una reaccin
se debe medir la concentracin de un sustrato
o del producto que se forma, bajo condiciones
especficas.
Se puede variar en distintas experiencias, la
concentracin del sustrato,pH, temperatura,
concentracin de ligandos especficos,
concentracin o naturaleza de un inhibidor,
etc.
Las concentraciones de S o P en momentos
diferentes se pueden determinar por
mediciones ,por ej, de la Absorancia u otro
mtodo adecuado
Recomendaciones
Las sustancias empleadas (sustratos,
buffers,ligandos,etc) deben ser lo ms puras
posible
Debe tenerse la certeza que el preparado de
enzima, que en muchos casos no es pura, no
contenga otras enzimas o protenas que
puedan alterar el resultado
Durante el tiempo que dure el experimento, l
enzima debe mantenerse estable
Es importante mantener constante el pH (uso
de buffers) la temperatura ( bao termosttico)
la fuerza inica, etc
Es conveniente medir velocidades iniciales
para evitar por ejemplo inhibicin por
producto, reacciones inversas , variacin de
(S)
Cintica experimental
Al derivar las ecuaciones clsicas utilizadas en
el estudio experimental de la cintica
enzimtica se supone que la concentracin de
la enzima es muy pequea comparada con la
concentracin del sustrato
Esto es generalmente vlido, debido a la gran
eficiencia de las enzimas
Si se miden las velocidades iniciales, la
cantidad de productos formados es
despreciable y la disminucin de la
concentracin del sustrato es tambin
despreciable y la velocidad de la reaccin es
directamente proporcional a la concentracin
inicial de sustrato
Se debe distinguir reacciones con un sustrato
de reaacciones multisustrato
Reacciones con un sustrato
Mecanismo de Michaelis Menten
Las enzimas que catalizan recciones con un
sustrato son: hidrolasas,isomerasas y la
mayora de las liasas
En un primer paso el sustrato se une a un sitio
especfico de la enzima, llamado sitio activo,
formando el complejo enzima- sustrato de
acuerdo al siguiente mecanismo
E + S ES E + P
Que se denomina mecanismo de
Michaelis-Menten
La unin del sustrato a la enzima se realiza por
fuerzas de tipo fsico: fuerzas de Van der Waals,
interacciones hidrofbicas e interinicas
El complejo enzima sustrato permite la
formacin del producto, que se separa de la
enzima,posteriormente, regenerndose sta
Ecuacin de Michaelis Menten
Como la formacin del complejo se produce por
interacciones de tipo fsico puede suponerse
que se llega rpidamente al equilibrio y se
define una constante de disociacin K
S,
como
Ks= [E] [S] / [ES]
Utilizando la aproximacin del equilibrio rpido
Michaelis y Menten en 1913, llegaron a
establecer la ecuacin
v = Vm [S] / Ks + [S]
Vm es la velocidad de la reaccin cuando
toda la enzima est unida al sustrato (
est saturada
Vm = k
2
(Eo)
Planteamiento de Briggs-Haldane
El mtodo del equilibrio rpido supone que la
reaccin de formacin del producto es mucho
ms lenta que el proceso de formacin del
complejo, sin embargo esto no siempre se
cumple
Briggs y Haldane propusieron otra deduccin
basada en el estado estacionario, obteniendo
una ecuacin: v = Vm [S] / ( k-1+k2/k1) + [S]
Donde k-1+ k2/k1 = Km
Actualmente la ecuacin de Michaelis Menten se
escribe
V = Vm [S] / Km + [S]
Representacin grfica de la
Ecuacin de Michaelis Menten
Las ecuaciones deducidas por MM y BH
corresponden a una hiprbole, Ks en la
deduccin de MM, es sustituida por Km, en la
BH
Se pueden obtener ecuaciones hiperblicas
similares si se consideran varias reacciones en
la etapa de formacin del producto, solo que
Km ser la combinacin de ms constantes
cinticas
La ecuacin de Michaelis Menten responde a la
cintica de muchsimas enzimas. Se dice
entonces que tienen una cintica michaeliana
Cintica michaeliana
Parmetros de la ecuacin de MM
Km es la concentracin de sustrato que
corresponde la mitad de la velocidad mxima
Su valor depende del sistema en estudio (
naturaleza de la enzima y el sustrato ), pH y
fuerza inica
Es una medida de la concentracin de sustrato
necesaria para lograr una catlisis eficaz
Se la relaciona con la afinidad de la enzima por
un sustrato dado. A mayor Km menor afinidad
de la enzima por el sustrato y viceversa, sin
embargo esto ser estrictamente vlido si Km =
Ks ,o sea si se cumple el equilibrio rpido
La velocidad de la reaccin se puede
considerar proporcional a la concentracin del
complejo ES y v = kcat [ES]
Cuando toda la enzima est unida al sustrato
se alcanza la velocidad mxima de la reaccin
Vm, entonces [ES] = Eo y
Vm= kcat [Eo]
kcat es una medida directa de la produccin
cataltica del producto en condiciones ptimas
( enzimas saturadas)
Se puede considerar como el nmero de
molculas de sustrato transformadas por una
molcula de enzima en la unidad de tiempo
Especificidad de la enzima
Los valores de Km y Vm(para calcular kcat) son
importantes para
-determinar la especificidad de una enzima respecto a cierto
sustrato
- decidir entre un mecanismo rpido y el estado estacionario
- conocer el rol de la enzima en el metabolismo
Para una enzima que puede trabajar con dos sustratos,
como [ES] = [E][S]/Km v = kcat/Km [E][S]tendremos
v1/v2 =(kcat/Km)1[E][S]1 / (kcat/Km)2 [E][S]2
y v1/v2 = (kcat/Km)1 / (kcat/Km)2 a concentraciones
iguales de sustrato
La relacin kcat/Km puede considerarse como una
medida de la especificidad de la enzima por un sustrato




Clculo de Km, kcat y Vm
Km y Vm se pueden calcular a partir de las
transformaciones lineales de la ecuacin de
MM
La determinacin de Vm, y a partir de all la de
Km, utilizando la grfica hiperblica no da
resultados correctos ya que el valor de Vm se
tendra solo a concentracin muy grandes
Para dicho clculo se pueden emplear grficos
obtenidos por linealizacin de la ec de MM
A partir de Vm y la concentracin empleada de
la enzima, se obtiene el valor de kcat = Vm/
[Eo]
Representaciones lineales
Se han propuesto varias transformaciones de la
ec. De MM que conducen a funciones lineales,
las ms utilizadas son:
Representacin de dobles recprocos o de
Lineweaver-Burk
Representacin de Eadie- Hoftee
Representacin de Hanes Woolf
Representacin directa de Eisenthal- Cornish
Bowden
Representacin de Lineweaver- Burk

Se obtiene la ecuacin al tomar la inversa de
ambos trminos en la ec de MM
1/V = 1/Vm + Km/Vm . 1/[S]
Al representar 1/V frente a 1/ [S], se obtendr
una recta, si la cintica es michaeliana,
La intercepcin con el eje de abcisas es 1/Vm y
con el eje de ordenads es -1/Km
Este tipo de representacin es a menudo
empleada al estudiar los tipos de inhibicin
La intercepcin de la recta con el eje de ordenadas es
1/Vm y la intercepcin con el eje de abcisas es 1/Km
Representacin de Eadie Hoftee
Multiplicando v por Km + [S] y luego dividiendo
el resultado por [S] se llega a la expresin
V = Vm Km V/[S] Ec de Eadie-Hoftee
Esta ecuacin tiene una sola recproca y los
puntos salen igualmente espaciados
La ordenada es Vm
La pendiente es - Km
Representacin de Eadie-Hoftee
Representacin de Hanes Woolf
Otra representacin a menudo empleada es la
de Hanes-Woolf, la ecuacin correspondiente
se obtiene multiplicando por[S] la ec de dobles
recprocas y ordenando
[S]/V = Km /Vm + 1/Vm . [S]
Se debe graficar [S]/V en ordenadas y [S] en
abcisas
La ordenada en el origen es Km/Vm y la
pendiente es 1/Vm
La intercepcin de la recta con el eje de
ordenadas es igual a - Km
Representacin directa
Cornish-Bowden y Eisenthal han propuesto otra forma
de representar los datos cinticos
Se consideran Km y Vm como variables, x e y
Se grafican directamente los valores de v y [S]
Los distintos pares de valores de v y S, se unen para
dar distintas rectas
Las varias rectas trazadas se deben cruzae en un
punto cuyas coordenadas son Km y V
En realidad , se promedian los valores ya que no
todas las rectas se cruzan en el mismo punto
Representacin directa
La ecuacin de Michaelis Menten puede ser
reordenada como
Vm = V + V/ [S]. Km,
donde Vm se toma como la variable y Km
como la variable x, as la ordenada en el origen
es V y -[S] es el valor de abcisas
El punto de intercepcin de las diversas rectas
que se pueden obtener con distintos valores de
v y [S]tiene como coordenadas Km (x) y Vm (y)
Inhibicin enzimtica
La velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas puede disminuir o anularse en
presencia de ciertas sustancias denominadas
inhibidores
El estudio de la inhibicion es importante desde
muchos puntos de vista
Muchos frmacos actan como inhibidores, el
empleo de ciertos inhibidores ha permitido
obtener informacin sobre el sitio activo de la
enzima. Se emplean inhibidores como
herbicidas
Tipos de inhibicin
Se distinguen:
Inhibicin reversible- La unin del Inhibidor y la
enzima es un proceso reversible que est
regulado por constantes de equilibrio. La
enzima puede inhibirse en mayor o menor
grado
Inhibicin irreversible: una vez que el inhibidor
se uni a la enzima ya no se separa, y la
enzima queda inutilizada , se vuelve inactiva
Tipos de inhibicin reversible
Se distinguen cuatro formas de inhibicin
reversible
- Inhibicin competitiva
-Inhibicin acompetitiva
-Inhibicin mixta
-Inhibicin no competitiva. Esta ltima es solo un
caso especial de la inhibicin mixta
Corresponden a la inhibicin lineal o simple
Inhibicin lineal e hiperblica
En la inhibicin reversible el inhibidor forma
un complejo dinmico con la enzima que
posee propiedades catalticas diferentes a las
de la enzima libre
Si la enzima unida al inhibidor, pierde
completamente su actividad cataltica cuando
est saturada, se tiene la inhibicin completa
o lineal( llamada as porque Km/Vm y 1/ Vm
dependen linealmente de la concentracin del
inhibidor)
Si el complejo enzima-inhibidor, en
condiciones de saturacin mantiene algo de
actividad se denomina inhibicin
hiperblica(por la forma que tienen las
representaciones de KM/Vm o 1/Vm frente a
(I) ) o inhibicin parcial
Inhibicin competitiva
La Enzima puede unirse al sustrato o al
inhibidor pero no a ambos simultneamente
Un inhibidor competitivo es una sustancia que al
combinarse con la enzima impide que sta se una al
sustrato
En muchos casos un inhibidor competitivo tiene una
estructura anloga a la del sustrato,ocupando el sitio
activo, por ejemplo la sulfanilamida se asemejan al
cido paraaminobenzoico e inhibe a la enzima que
participa en la sntesis del cido benzoico,vital para
las bacterias

El inhibidor competitivo puede ser un anlogo o
derivado del sustrato no metabolizable, un
sutrato alternativo o un producto de la reaccin
Se han estudiado casos de inhibicin
competitiva en que el inhibidor se une a la
enzima en un lugar diferente al sitio activo, pero
produce un cambio en la conformacin del
mismo e impide que el sustrato se una a la
enzima
El aumento de sustrato produce una
competencia con el inhibidor por la enzima y
para cierta concentracin de sustrato se puede
llegar a la misma velocidad mxima
Esquema de una inhibicin competitiva
Ks
E + S ES E + P K
EI
= [I] [E]/ [EI]
+
I
K
EI

EI A partir de este esquema se deduce la ec.
V= Vm [S] / (Km + K
EI
[I]/) + S
K
EI
o K
I
es la constante de disociacin del inhibidor
Km + [I]/Ki = Km aparente que es el valor obtenido
experimentalmente
La representacin recproca es
1/V = 1/ Vm + Km(1+[I]/Ki / Vm . 1/ [S]
La grafica de LB muestra una familia de rectas
que interceptan en el eje de ordenadas. La
intercepcin muestra que Vm tiene el mismo
valor sin ihnibidor o con distintas cantidades de
inhibidor, sin embargo se necesita una cantidad
mayor de sustrato para obtener la misma
velocidad mxima
Km aparente por otro lado disminuye a medida
que aumenta la concentracin de inhibidor
Es muy comn en muchas reacciones con un
sustrato:
Inhibicin no competitiva
El inhibidor y el sustrato se unen reversiblemente a la
enzima pero en sitios diferentes. Se pueden formar 3
tipos de complejos ES, EI y ESI
E + S ES E + P
+ Ks + k
2
Ks = (E) (S)/
(ES)
I I K
EI
= (E)(I) / (EI)


I
K
EI
K
ESI
K
ESI
= (EI) (S) /
(EIS)
EI + S ESI
K
ESI

Se definen
Ks = [E] [S]/[ES] = [EI] [S]/ ESI
Ki = [E] [I]/ [EI] = [ES][I]/[ESI]
Parte de la enzima est unida al inhibidor y al
inhibidor y sustrato como EI y EIS, por tanto
aunque se aade ms sustrato parte del
complejo formado ES se une a I, y es inactivo
por lo tanto la velocidad mxima disminuye y la
disminucin es proporcional a la [I]
Este tipo de inhibicin es rara en reacciones con
un sustrato, en cambio se han observado
muchos casos en reacciones multisustrato

La ecuacin correspondiente es_
Vm / (1+ [I]/Ki) . [S]
V= ---------------------------------
Km + [S]
La velocidad mxima disminuye y la Km
permanece inalterada
Las rectas que corresponden a distintas
concentraciones de inhibidor ,se interceptan en
el eje de abcisas en un punto
Inhibicin acompetitiva
Un inhibidor acompetitivo se une al complejo
ES, formando un complejo ternario ESI inactivo
La inhibicin acompetitiva pura es rara en
sistemas de un sustrato, se observa
generalmente en reacciones con 2 sustratos
E + S ES E + P
+
I
ESI
De acuerdo al esquema anterior se deduce la
ecuacin
Vmax/ (1+ [I]/Ki)
V = -----------------------------
Km/ (1+ [I]/Ki) + [S]
Las grficas de dobles recprocas obtenidas sin
inhibidor o en presencia de distintas
concentraciones del inhibidor son rectas
paralelas entre si, debido a que Vm y Km
disminuyen a medida que [I] aumenta
Se han observado ocos casos en reacciones
con un sustrato ( inhibicin de fosfatasa alcalina
de ratn con Lfenil alanina) , pero varios
ejemplos en reacciones con mas de un sustrato
(inhibicin de metionina adenosiltranferasa de
levadura por S-adenosilmetonina)

Gafica para la inhibicin
acompetitiva
Inhibicin mixta
Se forman tanto complejos binarios ES y EI
como ternario ESI
Las constantes de disociacin de los complejos
ternarios y binarios correspondientes al sustrato
o al inhibidor son diferentes
Se pueden relacionar Ki con K para la
descomposicin del complejo ternario formado
en ES e I, o Ks con K para la disociacin del
complejo EIS en EI yS
K = Ki o K = Ks
Esquema
Ks
E + S ES E + P
+ +
I I
Ki Ki
EI + S ESI
Ks
kp
La ecuacin correspondiente a la inhibicin
mixta clsica es
Vmax /( 1 +[I]/Ki ) [S]
V = -------------------------------------------
Ks (1 + [I]/Ki) + (1 +[I] / Ki) [S]
Las lneas que se obtienen con distintas concentraciones
de inhibidor se interceptan en un punto que puede estar
por encima o por debajo del eje de abcisas
El valor de la abcisas que corresponde al punto de
intercepcin de las rectas es - 1/ Ki
La intercepcin de la lnea que correponde a cierta
concentracin del inhibidor con el eje de abcisas es
- 1+[I]/Ki / 1 +[I] /Ki
Grficas obtenidas en la inhibicin
mixta a distintas concentraciones
del inhibidor
Diferencias entre los distintos tipos de
inhibicin lineal reversible
Los distintos tipos de inhibicin lineal reversible se
distinguen desde el punto de vista cintico por las
diferencias entre los valores de Km y Km ap ( en presencia
del inhibidor), y entre Vmax y Vmax aparente (con inhibidor) ,
es decir por el efecto del inhibidor sobre los parmetros
cinticos, antes que por el tipo de unin, dificil de determinar

Vmax Km
Inhibicin competitiva no vara aumenta
Inhibicin no competiva disminuye no vara
Inhibici acompetitiva disminuye disminuye
Inhibicin mixta disminuye aumenta

Resumen
Los casos limitantes de inhibicin lineal son:
inhibicin competitiva(especfica) y
acompetitiva(cataltica).
En aquellos casos en donde el tipo de
inhibicin no cae en ninguno de los modelos
anteriores, se habla de inhibicin mixta
La inhibicin pura no competitiva es un caso
de inhibicin mixta donde Kei = Kesi
La IUBMB recomienda considerar los distintos
tipos de inhibicin basndose en los efectos
sobre Vm/Km y Vm
Si Vm/Km disminuye, se dice que hay un
componente competitivo
Si el inhibidor no tiene efecto sobre Vm la
inhibicin es competitiva
Si hay el valor aparente de Vm disminuye hay
un componente acompetitivo
Si el inhibidor no tiene ningn efecto sobre
Vm/Km la inhibicin es competitiva
Si ambos componentes competitivo y
acompetitivo estn presentes la inhibicin es
mixta
Inhibicin irreversible
En algunos casos el inhibidor queda
fuertemente unido a la enzima por enlaces
covalente
En este caso la queda inutilizada y pierde en
forma permanente su actividad cataltica
Ejemplos de este tipo de inhibicin se observa
en el efecto txico de metales que forman
compuestos covalentes con las enzimas


Otros casos de inhbicin
Inhibidores pseudo irreversibles o fuertemente
unidos
Inhibidores suicidas
Inhibicin por producto
Inhibicin por sustrato
Inhibicin feedback
Enzimas con mltiples sitios
catalticos
Muchas enzimas estn constituidas por mltiples cadenas
formando oligmeros de 2, cuatro, seis u ocho
monmeros. Cada uno de estos monmeros puede tener
un sitio activo al que se une el sustrato
Estas enzimas pueden desempear un papel muy
importante en el metabolismo
Se distinguen dos grupos_:
- Todos los sitios son idnticos e independientes unos de
otros : no presentan cooperatividad
Si la presencia de una sustrato en un sitio, influye en la
ocupacin de los otros sitios activos, se dice que existe
cooperatividad
Enzimas con sitios no cooperativos
Considerando un dmero se pueden formar dos complejos
binarios ES y SE, y ESE, ternario,todos con las mismas
constantes de disociacin Ks y la misma constante cataltica
E + S ES E + P
+ +
S S

E+ P SE + S ESE SE + P

ES + P
Ecuacin para un sistema multisustratos no
cooperativo
La velocidad depender de la concentracin de
todos los complejos formados
V = k(ES) + k(SE) +2 k (ESE)
Reemplazando y simplificando se tiene
V/ Vmax = S/Ks (1+ S/Ks) / (1 + S/Ks) 2 y
simplificando y reordenando, se tendr
V/ Vmax = S/ Ks + S ec idntica a la de MM
Este tipo de enzimas darn cintica michaeliana y
por lo tanto por experiencias cinticas no se
pueden diferenciar de las enzimas con un sito
activo
Si se tiene un trmero la ecuacin que se
obtiene es
V/Vmax = S/Ks (1+ S/Ks)3 / (1 + S/Ks)4
Y simplificando y ordenando tambin se tendr
la ec. De MM
Enzimas que presentan
cooperatividad
Enzimas que presentan
cooperatividad
S i la unin del sustrato a un sitio activo
produce cambios estructurales o electrnicos
en la enzima que alteran la afinidad de la
enzima al siguiente sustrato que se une se
presenta cooperatividad
Las enzimas de este tipo no siguen la cintica
michaeliana y se llaman enzimas alostricas (
otro sitio), generalmente las curvas tienen
forma sigmoidea y la cintica se denomina
sigmoidal
Enzimas alostricas
Generalmente la unin de la primera molcula
de sustrato favorece la unin de la segunda
molcula y sta de la siguiente y as
sucesivamente. Se dice que hay cooperatividad
positiva
En algunos casos muy raros la unin de un
sustrato defavorece la unin del siguiente,
tenindose entonces cooperatividad negativa
Cuando la unin del sustrato es la que produce
cambios en el comportamiento de la enzima se
habla de respuesta homotrpica
Activadores e inhibidores de las
enzimas alostricas

Este grupo de enzimas es tambin sensible a la
unin de otras molculas distintas del sustrato
llamadas efectores o moduladores que
producen alteraciones en el comportamiento de
la enzimas respecto al sustrato, produciendo un
aumento de la actividad ( efectores positivos o
activadores) o una disminucin de la actividad
(efectores negativos o inhibidores). En este
caso se habla de efectos heterotrpicos.
Diferencia entre la cintica michaeliana y la
cintica sigmoidal
Papel regulador de las enzimas alostricas
Las enzimas alostricas tienen las siguientes
caractersticas
a)Presentan gran sensibilidad a las variaciones de
concentracin del sustrato, pueden pasar de una actividad
muy baja a concentraciones pequeas a gran actividad
con concentraciones mayores.
En una enzima de cintica michaeliana para aumentar la velocidad de
10 % Vm a 90 % Vm , la concentracin debe aumentar 81 veces, y
en una enzima alostrica, mucho menos, para 2 sitios activos es
necesario que aumente solo 9 veces
b) pueden ser reguladas por otras molculas (efectores) que
modifican la actividad de la enzima segn las necesidades
metablicas
Tratamiento de las enzimas
alostricas
Para estudiar las enzimas alostricas se
pueden emplear varios mtodos
- la ecuacin de Hill
- la ecuacin de Adair
- ecuaciones derivadas del modelo de Monod-
Wyman-Changeaux (MWCh)
- ecuaciones derivadas del modelo de Koshlan-
Nemethy-Filmer (KNF)
Considerando una enzima alostrica con 2 sitios activos
se puede llegar a la ecuacin
V/Vmax= S/Ks + S
2
/ a Ks 2 /1 + 2S/Ks + S
2
/aKs
Para una enzima con 4 sitios de unin se tendra
S/Ks + 3S
2
/aKs2 + 3 S
3
/a
2
bKs
3
+ S
4
/a3b
2
cKs
4
v/Vmax=---------------------------------------------------------------------
1+4 S/Ks + 6S
2
/aKs
2
+ 4 S
3
/a
2
bKs
3
+ S
4/
a
3
b
2
cKs
4

a, b, c etc. son los llamados factores de interrelaccin que
relacionan las constantes para los distintos complejos que se
pueden formar con Ks
O sea son los coeficientes por los cuales se multiplican las
constantes intrnsecas de los distintos complejospara dar la
constante de la disociacin de ese complejo; si son valores
pequeos la cooperatividad es fuerte y predominan las formas
E y ES
4


Ecuacin de Hill
La ecuacin de Hill se puede escribir a partir de
la funcin de saturacin Y
Y = (S)
h
/ K + (S)
Esta ecuacin corresponde a un sistema que
presenta gran cooperatividad, es decir si el S
se une a la protena inmediatamente se unirn
los siguientes y el equilibrio se puede
considerar entre E y Es
n
y K= (E) (S)
n
/(ES)
O tambin expresando en funcin a la
velocidad
Si la cooperatividad es muy fuerte y los
coeficientes de interaccin son muy pequeos
la ecuacin queda reducida a
v/Vmax = [S]
h
/ K' + [S]
h
Ecuacin de Hill
Donde K = a
3
b
2
c Ks
4
para un tretrmero, es
decir es una constante que relaciona la Ks con
los factores de interaccin
h es un coeficiente que se determina
experimentalmente,que no tiene un significado
fsico, es>1 si hay cooperatividad positiva y<1
si la cooperatividad es -
La ecuacin de Hill se puede linealizar ,
escribiendola en la forma
V / Vmax v = [S]
h
/K
Llevando a logaritmos
Log v/ Vmax-v = hlog [S] - log K
La pendiente es el valor de h, coeficiente de
Hill cuyo valor est relacionado con el nmero
de sitios de unin
Ecuacin de Adair
Adair propuso una descripcin ms real de la
unin de un ligando a una protena, para un
tetrmero consider 4 equilibrios y cuatro
constantes de disociacin. Considerando una
Enzima con 4 sitios de unin
E'+ S = ES K1 = (ES)/(E)(S)
ES + S = ES2 K2 = (ES2) / (ES) (S)
ES2 + S = ES3 K3 = (ES3) /(ES2)(S)
ES3 + S = ES4 K4= (ES4)/ (ES3) (S)
Fraccin de saturacin
La fraccin de saturacin de sitios activos puede
expresarse en funcin de la concentracin del
ligando libre,(A) y se llega a
(A)/K1+2(A)
2
/K1K2+ 3(A)
3
/K1K2K3+4(A)
4/
K1K2K3K4
Y ----------------------------------------------------------------------
4[1+(A)/K1+(A)
2
/K1K2+(A)
3
/K1K2K3+(A)
4/
K1K2K3K4]
En el caso de una Enzima con 4 sitios A= S
La relacin entre las constantes de disociacin y las
constantes intrnsecas K'1K'2K'3 y K'4 son:
K1 =K14 K2= 2K/3 K3 = 3K3/2 K4= 4K4
Si K'1>K'2>K'3>K'4 hay cooperatividad positiva
K'4>K'3>K'2>K'1 hay cooperatividad negativa
Ecuacn de Adair
Esta ecuacin tambin se puede expresar en
funcin a las constantes intrnsecas
A/K
1
+ 3A
2
/K
1
K
2
+3A
3
/K
1
K
2
K
3
+A
4
/K
1
K
2
K
3
K
4
Y=---------------------------------------------------------------
1+4A/K
1
+
6A
2
/K
1
K
2
+4A
3
/K
1
K
2
K
3
+A
4
/K
1
K
2
K
3
K
4

Empleando los valores experimentales de Y
como una funcin de (A) es posible deducir
valores adecuados para las 4 constantes de
disociacin
Modelo de Monod-Wyman-Changeaux
(modelo concertado)
Se propuso este modelo para explicar el
comportamiento de las enzimas alostricas
En el oligmero hay al menos un eje de simetra
La conformacin de una unidad depende de la
interaccin con otra unidad
El oligmero puede existir en 2 estados
conformacionales R (relajado) y T (tenso), que
presentan distinta afinidad para un ligando
Ambas formas existen en un equilibrio R T
Se emplean 3 parmetro L, y c
L = [To]/[Ro] = (A)/KR c= K
R
/K
T
Ecuaciones
Se evaluan dos cantidades Y y R
La fraccin de saturacin es:
Lc(1+c)
n-1
+ (1+)
n-1
Y = ---------------------------------
L (1+c)
n
+ (1+)
n


(1 + )
n

R = ---------------------------
L(1+c)
n
+ ( 1+ )
n
Enzimas K y V
De acuerdo a este modelo la cooperatividad
en la unin de ligandos se debe a que la
proteina esta preferentemente en uno de los
estados (por ej T) y el ligando se une a la
forma R, al unirse el equilibrio se desplaza de
T a R,
Al aplicar el modelo a las enzimas es ms
conveniente utilizar Vmax y Km
Las dos formas de la enzima tendrn distintas
afinidades por las formas R y T (Enzimas K)o
distinta actividad cataltica (Enzimas V)
Los efectores o moduladores de las enzimas
alostricas actan sobre el equilibrio RT
En las enzimas K,la unin del efector modifica
la afinidad de la enzima por el sustrato
variando Km Ej aspartato
cabamoiltransferasa activada por ATP e
inhibida por CTP
En las enzimas V , el sustrato tiene la misma
afinidad por las dos formas sin embargo
ambas difieren en su actividad cataltica, el
efector desplaza el equilibrio RT , variando
Vm Ej. fosforilasa b, activada por AMP
Modelo de Koshlan-Nemethy-Filmer
En ausencia de ligandos la enzima est en
una forma conformcional
Los cambios conformacionales son
secuenciales, las formas van cambiando a
medida que los ligandos se van uniendo
Las interacciones entre las distintas
subunidades pueden ser positivas o negativas
La expresin para la fraccin de saturacin se
puede obtener los equilibrios entre las
distintas formas, y sus constantes de
disociacin
Cada constante de disociacin se considera
que tiene 3 componentes
- Una constante de disociacin para la unin de la
subunidad ms favorecida
- una constante de equilibrio para el cambio de
conformacion
- constantes de interaccin que depende del
grado de estabilidad de los complejos entre
las subunidades en relacin a la estabilidad
del complejo solo
Las ecuaciones derivadas son ms complejas
que las correspondientes al modelo MWCh
Comparacin de ambos modelos
Ambos modelos el concertado de MWCh y el
secuencial de KNF puede ser considerados
como los extremos de un modelo ms general
que considera todas las conformaciones
posibles y de estados de unin al ligando

protena unida al
ligando
Este modelo da lugar a
ec extraordinariamente
complejas


En algunos casos la enzima se comporta de
acuerdo a uno de los dos modelos y en otros
no
Se pueden establecer 3 diferencias entre
ambos modelos
-el modelo concertado no explica la
cooperatividad negativa
-La observacin de cambios conformacionales
que se pueden monitorear en algunos casos
y determinar R e Y la grfica de R vs Y es lineal
en el modelo secuencial y curva en el
concertado
-demostracin de reacciones de idomerizacin
Las interacciones alostricas permiten un
alto grado de regularizacin del
metabolismo
Mtodos para estudiar enzimas reguladoras
Tipo de informacin mtodo de estudio
En los estudios cinticos Se realizan estudios de actividad
se observa cooperatividad Se observan las grficas si hay o no
linealidad
Se observa cooperatividad Se emplean mtodos como
equilibrio
en los estudios de ligando? De dilisis, de ultracentrifugacin
Las molculas reguladoras Prueba sobre efectos de los
se unen a sitios diferentes alS? Moduladores en las curvas cinticas
Consiste la enzima en varias El nmero de subunidades puede
subunidades? Determinarse por M, simetra, y otros
Enzimas que actan en reacciones con
dos sustratos diferentes
Muchas enzimas trabajan con dos sustratos
diferentes, las deshidrogenasas por ejemplo se
unen al sustrato que se oxida y al NAD+
aceptor de los protones y electrones
En la mayora de los casos, se puedeestudiar
este tipo de reacciones teniendo en cuenta la
cintica un sustrato, cuando se mantiene
constante la concentracin de uno de los
sustratos y se vara la concentracin del otro

Se distinguen los siguientes tipos de
mecanismos
Cuando se distingue un compuesto ternario
Mecanismo secuencial ordenado
Mecanismo secuencial aleatorio
Cuando no se distingue un compuesto ternario
Mecanismo ping-pong
Mecanismo Theorell-Chance
Mecanismo secuencial ordenado
Los sustratos se unen a la enzima en un orden
determinado, y los productos tambin siguiendo cierto
orden
A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E
Este tipo de mecanismo se observa en las
deshidrogenasas que actan con NAD*, donde la
coenzima se fija en primer lugar y luego el sustrato
que se oxida. La unin del dinucletido produce una
modificacin de la enzima favoreciendo la unin del
sustrato
As tambin se libera primero el producto y luego el
NADH

Mecanismo aleatorio o al azar
Los sustratos pueden unirse en cualquier orden
y la liberacin de los productos tambin se hace
en forma aleatoria
A EA B P \/ Q
E EAB EPQ
B EB A Q P


Mecanismo de Theorell- Chance
Es un caso de mecanismo ordenado en que el
complejo ternario no se acumula,y no se
observa en las condiciones en que se realiza la
reaccin
Este tipo de mecanismo se observa en la
alcohol deshidrogenasa de hgado de caballo
A B P
E EA -------- EQ ------E + Q
Se libera primeramente acetaldehido y luego el
NADH
Mecanismo ping-pong o de doble
desplazamiento
En este mecanismo no se forma compuesto
ternario
La enzima se une primero a un sustrato, se
forma el complejo binario y se libera un
producto y la enzima queda modificada en
forma covalente, esta forma se une luego al
segundo sustrato, se forma el complejo
correspondiente y se libera otro producto, la
enzima vuelve a la forma inicial
E + A EA E + P
E + B EB E + Q
Este mecanismo se observa en muchas
enzimas, sobre todo en las que participan en la
transferencia de grupos

Empleando el esquema de Cleland

A P B Q
_________ _
E EA E'P E'Q E'B EQ E
Este tipo de mecanismo es muy comun en muchas
enzimascomo transaminasas y flavoenzimas por
ejemplo la aspartato transaminasa que pqrticipa en
la reaccin
Glutamato+Epiridoxal 2oxoglutarato
+Epiridoxamina
Oxaloacetato + Epiridoxamina aspartato +
Epiridoxal
Las grficas que se obtienen cuando se
mantiene la concentracin de un sustrato
constante y se vara el otro,y se toma 1/v vs.
1/[S] son rectas paralelas entre s
Este tipo de mecanismo se observa tambin en
varias enzimas de transferencia de fosfatos,
como la fosfoglicerilmutasa
Se produce primero una reaccin donde un
grupo fosforilo se transfiere a la enzima dando
un derivado fosforilenzima, el grupo fosfato es
transferido luego a un segundo sustrato y la
enzima se separa en su forma inicial
En el mecanismo Ping-pong el grupo G es
transferido dos veces del 1er sustrato a la
enzima y de esta al 2do sustrato, se
denomina por eso de doble desplazamiento
Los mecanismos con formacin de compuesto
ternaario donde el grupo G se transfierre una
sola vez se denomina de desplazamiento
simple
Esta divisin fue introducida por Koshland y
se refiere ms a aspectos qumicos que
cinticos
Ecuaciones en cintica de dos
sustratos
Para obtener las ecuaciones de velocidad en
la cintica de dos sustratos se puede aplicar
el mtodo de King y Altman,considerando
diversos mecanismos posibles o no, sin
embargo esto da lugar a mltiples ecuaciones
y es ms til emplear otros caminos
Por ej para el mecanismo ordenado la
ecuacin hallada contiene 13 coeficientes,
cuando selo puede haber 8 constantes de
velocidad
Recomendaciones de la IUBMB
Las constantes consideradas pueden
reducirse a 3 tipos: Velocidades
limitantes (Vm)
Constates de Michaelis (Km)
Constantes de inhibicin (Ki)
Las Km respecto a A o B corresponde a la Km
en la cintica de un sustrato
Las Ki respecto a A o B corresponde a Ki cuando
A (oB) se consideran como producto inhibidor
de la reacin inversa
Si se conoce la (E) puede calcularse las
constantes catalticas y calcularse las
constantes de especificidad

Ecuaciones
Para el mecanismo al azar, suponiendo el equilibrio
rpido se puede llegar a
V+ (A)(B) - V-(A) (B)
v= Ki
A
KmB KiQ KmP
1+(A)/Ki
A
+(B)/Ki
B
+(P)/Ki
P
+(Q)/Ki
Q
+(A)(B)/Ki
A
K
MQ
+(P)(Q)//KipKmq
Sin embargo sise toman las velocidades iniciales donde las
concentraciones iniciales de productos son despreciables y
multipliando por KiAKmB la ecuacin se reduce a
V(A)(B)
v= -----------------------------------------------
KiAKmB + KmB (A) + KmA(B) + (A)(B)
Vm o V es la velocidad lmite cuando la enzima
est saturada con ambos sustratos
Si la cocnentracin de uno de los sustratos es
mucho mayor que la del otro , por ej B, la
ecuacin se reduce a v = V(A)/ KmA +(A)
Asi se puede definir KmA como el valor de la
constante lmite de Michaelis para A cuando B
est en una concentracin saturante
De igual modo KmB es el valor de Km para B
cuando A est en concentracin saturante
Parmetros aparentes
Para estudiar la cintica de las reacciones con dos sustratod
se debe repetir varias veces la experiencia, manteniendo en
cada la concentracin de un sustrato constante, por ej B y
variando el otro
La ecuacin tomar la forma
v= V(B)/KmB(B) (A) / KiAKmB+ KmB(B)/KmB+(B)
donde ser constantes V(B)/ KmB(B) = V ap
y KiAKmB +KmA(B)/ KmB + (B) = Kmap
Los parmetros Vmap, Kmap y Vmap/Kmap son funcin
de la concentracin de B
Grficas primarias y secundarias en los
mecanismo con complejo ternario
Los datos obtenidos experimentalmente se pueden
llevar a cualqiera de los grficos lineales L-B H-W o E-
H,tales grficas se denominan primarias
En la representacin de L-B se obtienen rectan que se
interceptan en el 2do cuadrante en un punto cuya abcisa
es -1/KiA y la ordenada 1/V(1-KmA/KiA)
Esta grfica da directamente el valor de KiA, los otros
parmetros se obtienen de grficas secundarias
Vapvs o Vap/kmap vs (B) corresponden a hiprbolas y
la grafica de dobles inversan dan rectas
Representando 1/Vap vs 1/(B) se obtiene una recta cuya
pendiente es KmB/V y en el eje de abcisas -1/KmB
Kmap/(B) vs 1/(B) da como pendiente KiAKmB/V
Grficas en el mecanismo pingpong
En ausencia de productos la velocidad inicial
es
v= V (A) (B) / KmB (A) + KmA (B) + (A)(B)
Si se toman valores constantes de B y se
vara A se tiene
Vap = V(B) / KmB + (B)
Kap = KmA (B) / KmB + (B)
y Vap/Kmap = V/ KmA, valor que no depende
de (B)
Ls grficas de 1/v vs 1/ (A) son rectas
paralelas entre s
Las grficas secundarias 1/Vap vs (B), tiene
una pendiente igual a KmB/V y la intercepcin
en ordenadas es 1/V
Kmap vs (B) tiene pendiente 0

Retroinhibicin o inhibicin feed-back
En muchas vas metablicas importantes se observan
casos de la llamada inhibicin feedback o
retroinhibicin, cuando un producto final de una va
metablica se encuentra en exceso , acta como
inhibidor de una enzima que participa en una reaccin
al comienzo de la va, disminuyendo as la velocidad
de la reaccin dada y por lo tanto disminuyendo
tambin el producto considerado
A B C D
E1 E2 E3
El exceso de D acta como inhibidor de la enzima E1

En muchos casos una va metablica se
difurca, y a partir de un metabolito se pueden
formar dos o ms productos por caminos
diferentes

En el esquema anterior los productos G y J
pueden inhibir a la primera enzima de la va E1
o actuar solamente sobre la enzima donde se
inicia la bifurcacin correspondiente E4 o E7
respectivamente
En el primer caso disminuiran todos los
metabolitos desde B en adelante, en el segundo
caso, disminuira la va correspondiente, si
afecta a E4, E,F y G, o si afecta a E7 , H I y J
Inhibicin por 2 inhibidores
Se suelen distinguir los distintos tipos de
inhibicin
Competitiva
Cooperativa
Concertada
Aditiva
Acumulativa
Secuencial
Inhibicin cooperativa
Dos inhibidores diferentes X e I se unen a la enzima a
distintos sitios de unin
La unin de cualquiera de los inhibidores X o I,puede
actuar solo, impidiendo la unin del sustrato
X solo o I solo, tienen efecto inhibitorio, pero la accin
conjunta tienen un efecto mayor que la que tendra X solo
o I solo auna concentracin equivalente a la
concentracin total de ambos
Se pueden formar EXI, EXIS
A nivel de saturacin cualquiera de los inhibidores puede
hacer que la velocidad llegue a cero
Ejemplo Fosforibosilaminasintetasa
Esquema de retroinhibicin


FG H I
E1 E2 E3 E4 E9
S B C D N
E5 J K L X
E6 E7 E8
E 10 E11 E12
Inhibicin concertada
La inhibicin se produce solamente con la
accin simultnea de los dos inhibidores
Ni X ni I tienen ningn efecto solos (por
ejemplo EX yEI tienen la misma afinidad por el
sustrato pero EXS y EIS son catalticamente
activos, pero EXI no puede unirse al sustrato y
por los tanto no forma producto
La unin de X o I a la enzima aumenta la
afinidad por el otro inhibidor
Ejemplo: algunas aspartil quinasa
Imhibicin acumulativa
Cada producto final es un inhibidor parcial., I
solo ni X solo pueden hace que la velocidad de
la reaccin se anule.
Esto implica que EX e Ei se unen a S pero no
tan bien como S, o que EXS o EIS no son tan
activos como ES
Ejemplo: gutamina sintetasa
Inhibicin aditiva
Hay dos enzimas diferentes que son inhibidas,
cada una sensible a un retroinhibidor o dos
sitios catalticos en la enzima de modo que
ambos pueden ser ocupados simultneamente
por ambos inhibidores
Ejemplos_ algunas aspartilquinasas

Inhibicin secuencial
I inhibe a una enzima de la ruta metablica y X
inhibe a otra enzima que acta ms adelante
Cuando ambos inhibidores X e I tienen
concentraciones altas, los dos procesos se
inhiben y aumenta la cantidad de un metabolito
N puede inhibir a otra enzima