Prof. Dra.

Viviana Varela
Ctedra de Gentica y Biol. Molecular
Fac. Farmacia y Bioqumica U.B.A.
MAESTRA EN BIOLOGA MOLECULAR MDICA
Gentica y Citogentica Molecular Mdica 2013
Area Gentica Molecular
Clases tericas
13 sept. Generalidades, Patologas Hereditarias.
Estrategias de Diagnstico Molecular
Fibrosis Qustica
Prof. Dra. V. Varela
14 sept. Gentica Molecular de Hemoglobinopatas Prof. Dra. V. Varela
20 sept. Patologa Hereditaria Tiroidea Prof. Dra. C. Rivolta
21 sept.
FERIADO
27 sept. Neurobiologa Molecular Dra. F. Giliberto
28 sept. Bases moleculares de Patologas
Multifactoriales I
Dra. G. Cerrone

4 oct. Bases moleculares de Patologas
Multifactoriales II
Dra. G. Cerrone
19 oct. Bases Moleculares de las Disgenesias
Gonadales
Dra. S. Copelli
Clases prcticas
5 oct. Trabajos Prcticos I
11 oct. Trabajos Prcticos II
12 oct. Trabajos Prcticos III
18 oct. Trabajos Prcticos IV
19 oct.

TERICA
25 oct. Trabajos Prcticos V
Discusin de resultados de TP
Evaluacin final: sbado 26 de octubre
Gentica Molecular Mdica
Bases moleculares de patologas moleculares
herencia
gen o genes implicados
tipos y fecuencia de mutaciones

Estrategias de diagnstico molecular

Asesoramiento gentico (previo y posterior al diag. molec.)
para el paciente
para el grupo familiar

patologa
gen
mapeo
genmico
secuencia
expresada
GENTICA
INVERSA

tratamiento
medicina
gentica
diagnstico
diagnstico
funcin
alterada
protena
GENTICA
CLSICA
estudio de la patologa molecular

entender como una
VARIACIN EN LA SECUENCIA
DE ADN
produce un fenotipo particular
Diagnstico molecular en humanos
Permite detectar el defecto primario en una patologa molecular
Detectar marcadores de predisposicin en patologas complejas

Identificar un individuo
Establecer la histocopatibilidad entre dos personas

Tipificar un tumor

Determinar el genotipo de un individuo

Deteccin de un genoma externo: presencia de un agente patgeno

Etc., etc., etc.....


establecer una terapia
farmacolgica adecuada
El diagnstico molecular permite detectar el defecto
primario en una patologa


Por qu? cundo?
no se puede medir la actividad biolgica de la protena implicada
diagnstico confirmatorio o diferencial entre varias patologas
diagnstico presintomtico (la protena an no se expresa en el
momento en que se hace el diagnstico)

A quin?
Al paciente
Al grupo familiar
A una poblacin


nio
Adulto
embrin implantado
embrin antes de implantar
CLASIFICACIN DE PATOLOGAS
SEGN SU PREVALENCIA
Enfermedades raras: (poco frecuentes)
afectan a menos de 1 / 2.000 individuos (0,05 % de la poblacin).
Hay catalogadas alrededor de 20.000
http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php?lng=ES
la mayora son genticas, los sntomas pueden comenzar a cualquier edad
En Argentina >se calcula que existen entre 5.000 y 8.000 patologas
>hay ms de 3 millones afectados (6-8% de la poblacin)
-Federacin Argentina de Enfermedades Poco Frecuentes (FADEPOF)

La falta de investigacin y desinformacin afectan
a millones de pacientes con enfermedades raras

Enfermedades frecuentes: mayor prevalencia, ej. diabetes
FACTORES
GENETICOS
FACTORES
AMBIENTALES
Patologas de pesquisa neonatal:
-base gentica
-modificacin ambiental: tratamiento corrige o mejora el defecto
Ej: fenilcetonuria
-imposibilidad de metabolizar fenilalanina
-deficiencia de fenilalanina hidroxilasa
-mutaciones en el gen PAH
-tratamiento: dieta pobre en fenilalanina

AUTOSMICA
Pares de cromosomas 1>22
PATOLOGA HEREDITARIA
Dominante
enf. Huntington
poliquistosis renal
ataxia espinocerebelosa
Recesiva
fibrosis qustica
fenilcetonuria
hipotiroidismo congnito
galactosemia
PATOLOGA HEREDITARIA
LIGADA AL CROMOSOMA X
dominante
hipofosfatemia
(raquitismo)
recesiva
daltonismo
hemofilia A, B
distrofia musc. de Duchenne
LIGADA AL CROMOSOMA Y
disgenesias gonadales
ej. mujer 46,XY mutacin en SRY

MONOGNICAS
monoallicas
drepanocitosis
COMPLEJAS o MULTIFACTORIALES
PATOLOGA HEREDITARIA
poliallicas
hemoglobinopatas
fibrosis qustica
Distrofia Muscular de
Duchenne / Becker
diabetes mellitus ateroesclerosis
hipertensin arterial accidente cerebro vascular
CLASIFICACIN MOLECULAR DE LAS
ENFERMEDADES HUMANAS
Exgenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales....

Segn el tipo Germinales
de clula Somticas (cncer)


Cromosmicas numricas
Segn el tipo de estructurales
alteracin
Gnicas mutaciones puntuales
inserciones y deleciones

Segn el genoma Nucleares autosmicas
y cromosoma ligadas al sexo
afectados
Mitocondrial

Complejas o multifactoriales: en parte exgenas y en parte genticas
Genticas
ED Green et al. Nature 470, 204-213 (2011) doi:10.1038/nature09764
Gregor Mendel
Watson y Crick
Proyecto Genoma
Humano Medicina genmica
sigloXX
-bases celulares de la
herencia (cromosomas)
-bases moleculares de la
herencia (ac. nucleicos)
-bases de la expresin de la
informacin gentica

Desarrollo de tecnologa del
ADN recombinante

-informacin de
genomas completos y
comprender su estructura,
funcin y evolucin
-planteado a principios de la dcada de los 80 por el Consejo Nacional de
Investigacin de Estados Unidos (US National Research Council)
-adquirir una visin global de la estructura del genoma
1. La evolucin de la humanidad
2. El origen de muchas enfermedades
3. La interrelacin entre el ambiente y la herencia en la expresin fenotpica
-14 de abril de 2003: Anuncio oficial de finalizacin de la secuenciacin
del genoma humano.
-2006: se complet la sec. de los 24 cromosomas
CADA INDIVIDUO ES NICO
2 individuos comparten el 99,9 % de su genoma
3 billones de pb
se diferencian en 3 millones de pb
Variacin gentica
=
Variacin de secuencia
VARIABILIDAD GENMICA
VARIACIN DE SECUENCIA
cambio en la secuencia de bases del ADN
-cualquier cambio tomando como referencia el genoma wild type
-los cambios pueden afectar la expresin de los genes sin alterar las
secuencias codificantes
-los cambios pueden no producir cambios fenotpicos (mutaciones
silenciosas)

POSITIVO
evolucin
NEUTRO

NEGATIVO
enfermedad
EFECTOS
Mutacin o polimorfismo?
mutacin polimorfismo
-cambio -cambio
-<1% ->1%


cuando se quieren describir cambios desde el punto de vista
estructural, es mejor usar trminos neutros

variacin de secuencia
variante gentica
variante allica
alteracin
genera patologa?
Tipos de cambios

Cambio en la secuencia
ACATCAGGAGAAGATGTTC-GAGACTTTGCCA
ACATCAGGGGAAGATGTTT-GAGACTTTGCCA
ACATCAGGAGAAGATGTTCCGAGACTTTGCCA
Cambio en la cantidad (dosis)


Cambio de posicin
SNP (single nucleotide polymorphism) (1 pb)
INDEL (inserciones-deleciones) (1-1.000 pb)
incluyen:VNTR (variable number tandem repeats): STR, VNTR
CNV (Variaciones del nmero de copias) (>1.000 pb)
Tipos de Variaciones de Secuencia
SV (Variantes Estructurales)
SNP indel
SNP
Locus (loci): posicin definida ocupada por un gen o una secuencia de
ADN en ambos cromosomas homlogos
Alelo: secuencia de ADN en un locus

Si en un locus se produce una mutacin > existirn 2 variantes allicas

SNP (SNV: single nucleotide variation)

-origen: una variante de secuencia nica que se propag a la poblacin
-15.000.000 en genoma humano
-distribuidos en todo el genoma
Primer individuo
poblacin
actual
tiempo
evento
mutacional
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP
INDEL
(inserciones y deleciones pequeas)
Tamao: 1 a 1.000 pb
2 millones de INDELs
La mayora son menores a 100 pb
Distribuidos en todo el genoma
Ms de 800.000 mapean en genes (2.100 en exones)
CONTRIBUYEN A LA DIVERSIDAD FENOTPICA
Natural genetic variation caused by small insertions and deletions in the human genome.
Ryan E. Mills, et al. Genome Res. 2011 June; 21(6): 830839.
INDEL

F508 (F508del):
NDEL de 3 pb: mutacin ms frecuente en FQ
codones 505 506 507 508 509 510

ADN ... AAT ATC ATC TTT GGT GTT.....
protena ... Asn Ileu Ileu Phe Gly Val.....
-Alelo normal
-Alelo mutado: F508
ADN ... AAT ATC AT- --T GGT GTT.....
Protena ... Asn Ileu Ileu Gly Val....
Short Tandem Repeats (STRs)
Short tandem repeat (STR) = microsatlite =
simple sequence repeat (SSR)
A: 5 repeticiones
B: 7 repeticiones
C: 11 repeticiones
D: 14 repeticiones
E: 17 repeticiones
Unidad de repeticin
Alelos
Homocigota = ambos alelos son del mismo largo
Heterocigota = los alelos tienen largos distintos y pueden distinguirse uno del otro
Tipos de unidades repetitivas de STRs
Dinucletido (CA)(CA)(CA)(CA) (CA)
n

Trinucletido (GCC)(GCC)(GCC) (GCC)
n


Tetranucletido (AATG)(AATG)(AATG) (AATG)
n


Pentanucletido (AGAAA)(AGAAA) (AGAAA)
n


Hexanucletido (AGTACA)(AGTACA) (AGTACA)
n
VARIACIN DE NMERO DE COPIAS
Copy Number Variation (CNV)
segmentos de ADN de 1.000 pb a megabases
presentes en nmero de copias variable
en comparacin con un genoma de referencia

puede incluir: inversiones y translocaciones equilibradas
desequilibrios genmicos (inserciones y deleciones)

existen en humanos y otras especies


VARIACIN DE NMERO DE COPIAS
Copy Number Variation (CNV)
Secuencias largas de ADN miles a millones de pb
EST RELACIONADO A LA VARIACIN DE N DE COPIAS

Individuo: posee 2 copias (genoma diploide)
delecin > 1 copia
insercin > 2 copias o ms
duplicaciones
rearreglos complejos


-anlisis de Tros (fase I HapMap)
Inconsistencias de herencia mendeliana
Common deletion polymorphisms in the human genome
S. McCarroll et. Al. Nature Genetics 38, 86 - 92 (2006)

C-T T-T
C-C >C-del???
http://flipper.diff.org/app/pathways/3685
Distribucin de CNV en el genoma humano
39 individuos control sanos no relacionados

las prdidas de copia

las ganancias de copia

N de crculos= n personas

Ao: 2011
Chen W, Hayward C, Wright AF, Hicks AA, et al. (2011) Copy Number Variation across European Populations.
PLoS ONE 6(8): e23087. doi:10.1371/journal.pone.0023087
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0023087
Distribucin de CNV en Poblacin Europea
Resultados de fase III (2010): SNP CNV (1.184 individuos / 11 poblaciones)
Variantes Frecuencia (alelo
menor)
Caratersticas
poblacionales
comunes 5,0 % En general en todo el
mundo
Bien caracterizadas en
Hap Map I y II
de baja
frecuencia
0,5 5 % Compartidos entre
poblaciones
relacionadas, pero con
frecuencias variables
Se espera que el proyecto
1000 Genomas pueda
caracterizar muchas de
estas variantes
raras 0,05 0,5 % Especficas de
determinado grupo
privadas Singleton 0,05
%
Restringidas a un
individuo o familia
The International HapMap Consortium. Integrating common and rare genetic variation in diverse human populations.
Nature 467, 52-58. 2010
catlogo de las variaciones genticas ms comunes en los seres humanos
HapMap Project
http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/
VARIACIONES ESTRUCTURALES
Structural Variation (SV)
Genome structural variation discovery and genotyping
Can Alkan; Bradley P. Coe; Evan E. Eichler
Nature Reviews Genetics 2011 Vol: 12(5):363-376.
-inserciones, deleciones, inversiones, translocaciones
-contribuyen a la variacin del genoma en humanos y otras especies






-existen SV germinales
SV somticas (adquiridas durante la vida, ej: cncer)
-hay ms de 5.000 enfermedades genticas
Variacin de secuencia
(cambio en la informacin gentica tomando, como
referencia, el genoma wild type)
>frecuencia menor al 1,0 %
> son causa de la PATOLOGA MOLECULAR
MUTACIN
-cambio en la informacin gentica
informacin codificante
seales expresin
maduracin y estabilidad de los
transcriptos

gt ag
Ex2
in1
5
3
Ex1
r.promotora
TAA
TAG
TGA
ATG
*
*
AATAAA
Clasificacin de mutaciones

-por tamao
Inserciones / Deleciones

Puntuales
>regin codificante silenciosa
cambio de sentido
stop de sntesis proteica
antisentido
cambio de marco de lectura

>regin no codificante reg. promotora
splicing
regin 3UTR

-por estabilidad estables
dinmicas

-por funcin prdida de funcin
ganancia de funcin
Nomenclatura de genes:
Hugo Gene Nomenclature Comittee




Nomenclatura de variaciones de secuencia
(mutaciones y polimorfismos):
http://www.hgvs.org/mutnomen/
-a nivel del ADN: A,T,C,G g.3245T>C
c.957G>T
m.1004T>C

-g. el problema es el tamao de los contigs
g.21.895.321_21.895.325del
NT_035218.23 tiene 70 Mb

-c. sirve en el contexto de genes
posicin 1: ATG
signo negativo: (-) posiciones a 5 del ATG ej: c.-3T>C
asterisco: a 3 del codn de stop final ej: c.*103
intrones: c.85+2t>g (desde el comienzo del intrn)
c.86-1g>a (desde el final del intrn)

-a nivel del ARN

-a nivel de la protena

Nomenclatura para la descripcin de variantes de secuencia
http://www.hgvs.org/mutnomen/
Estrategias de Diagnstico Molecular
para Patologas Hereditarias
Pasos a seguir en diagnstico molecular de patologas
1-identificar el fenotipo del paciente
diagnstico clnico - antecedentes familiares
tests bioqumicos

dependiendo de las bases las moleculares
-modo de herencia
-gen o genes implicados
-mutaciones

2- realizacin de tests genticos
(moleculares, citogenticos)

3-asesoramiento gentico



Disear el sistema de diagnstico
-no importa la complejidad de las tcnicas usadas
-se adaptarn a:
complejidad de laboratorio
n de muestras a procesar
costos de las determinaciones
La tcnica debe permitir visualizar todos los genotipos
esperados para el cambio:
Ej. para doble dosis de cromosomas:
normal / normal normal / mutado mutado / mutado
En qu muestras?


ARNm > ADNc
1.000 cl. = 3 ng de ADNg
cel. embrionarias
leucocitos
epitelio bucal
vellosidades
corinicas
ADNg
DIAGNSTICO MOLECULAR
Diagnstico directo
identificar una o ms mutaciones
-muestra de un individuo
M
Diagnstico indirecto
identificar el cromosoma afectado
-muestras de la familia
MUTACIONES
CLASIFICACION POR TAMAO
macrolesiones: alteraciones cromosmicas
-estructurales
-numricas
citogentica
microlesiones: alteraciones gnicas
de megabases a
1 pb (mutacin puntual)
biol. molecular
El tamao y tipo de mutacin decidir la o las
tcnicas de eleccin
grandes mutaciones
Southern Blot; PCR-GAP
MLPA
pequeas mutaciones
PCR + tcnicas complementarias
Anlisis de un INDEL
PCR+ electroforesis
5.000 pb
I/I D/D I/D
3.500 pb
Anlisis de mutaciones pequeas PCR - RFLP
Ej: mutacin> desaparece sitio de restriccin para EcoRI
Ex.1 Ex.2
PCR: 500 pb
Alelo normal: 200+300 pb
Alelo mutado: 500 pb
N/N N/M M/M
500 pb

300 pb
200 pb

Anlis de mutaciones pequeas
PCR > secuenciacin
PCR
Alelo normal: ...TTGGCAAACAATTCA...
Alelo mutado:...TTGGCAAAGAATTCA...
Secuenciacin - SNP
SNP: alelo A
alelo C
indiv.1 indiv.2
TCAG TCAG



CA AA
G-A G-A
Dot-Blot e hibridacin con
sondas de oligonucletidos aleloespecficas(ASO)
PCR
desnaturalizacin
alcalina
siembra en
membrana
(por duplicado)
hibridacin
con ASO
Sonda Normal
Sonda Mutada AAGTTGTACGTTCTAGGCGT
AAGTTGTACCTTCTAGGCGT
Sonda Normal
Sonda Mutada

1 2 3 4 5 6
Resultado de hibridacin
N/N N/M M/M
Dot-Blot reverso
INNO-LiPA (Line Probe Assay)
PCR (ADN paciente)
sonda
Biotina
Estreptavidina
Fosfatasa alcalina
Cromgeno
(NBT/BCIP)
Precipitado
prpura
Tira reactiva
Dot-Blot reverso
Inno-Lipa CFTR

36 mutaciones
4 cuadruplex: 4 pares de primers cada una = 16 exones
Se estudiaron las zonas ms propensas a sufrir deleciones en el gen de la distrofina
(Mix I, Mix II, Mix III y Mix IV).

3

5
Mpm 3 4 8 17 44 48 19 45 51 52 13 43 50 47 60
90 % de las
deleciones
PCR Multiplex
MIX
IV
40
6
40
7
- 408B +
EXON 43 (357 pb)
EXON 60 (139 pb)
EXON 47 (181 pb)
EXON 50 (271 pb)
ELECTROFORESIS AUTORRADIOGRAFIA
23,13 Kb

9,41 Kb

6,56 Kb

4,36 Kb

2,32 Kb
2,03 Kb
14,0 Kb
10,3 Kb
Anlisis de deleciones en los genes de -globina
Southern blot
: 14Kb


-
3.7
:10,3Kb



2 2 1

Enzima de
restriccin:
BamH I
F R(normal) R (del)
Anlisis de deleciones: GAP-PCR
N: 1800 pb


M: 1400 pb

M 1 2 3 4 5 6 M
3560
3215/3233
2838
2430
2040
1632

1193

841


402
3560
3215/3233
2838
2430
2040
1632

1193

841


402
F R (del)
N/N N/M M/M
N: 1800 pb


M: 1400 pb

(CAG)n
HD3 HD5
ex. 1 - IT15
PCR
32
P
Tipificacin de nmero de tripletes en Enf. de Huntington
Alelos mutados
Alelos normales
PCR: con primer forward
marcado con FAM
Tipificacin de alelos por secuenciacin automtica
2 alelos en rango normal
18 / 56 repeticiones 21 / 39 repeticiones
Diagnstico indirecto
identificar el cromosoma afectado
-muestras de la familia
Estudio de segregacin de alelos
mediante el uso de marcadores moleculares
Varios marcadores moleculares, asociados entre si, o con
otras variantes de secuencia, configuran un haplotipo

Haplotipo grupo de marcadores genticos que estn
fsicamente ligados y tienden a heredarse juntos.
marcadores moleculares

Se debe conocer la posicin en el genoma
Debe ser polimrfico

>RFLP
>SNP
>INDEL
>VNTR: variable number of tandem repeat
Microsatlites - STR: 1-4 nt 100-200 pb
Minisatlites - VNTR: 10-65 nt > 1.000 pb
>CNV
>bandeo cromosmico
A/B
B/C
A/C A/B
?
H1 H2
P M H1 H2
A-
B-
C-
Alelo A
Alelo B
Alelo C
Short Tandem Repeats (STRs)
ASESORAMIENTO
GENTICO
Ctedra de Gentica y Biol. Molecular
Fac. Farmacia y Bioqumica U.B.A.
y as empezamos...