Validao dos mtodos cromatogrficos por CLAE

Grupo: Ariene Medina, Kerciely Martins, Larissa Ferreira,

Malayne Bastos e Matheus Castro

Qumica III
Na rotulagem nutricional obrigatria de alimentos
industrializados, alm da declarao de carboidratos, protenas,
gorduras totais, gorduras saturadas, gorduras trans, fibra
alimentar e sdio, as vitaminas e os minerais, optativamente
podem ser declarados, sempre e quando estiverem presentes em
quantidade igual ou maior a 5% da ingesto diria recomendada
(IDR) por poro indicada no rtulo.
Assim, se fazem necessrios o desenvolvimento e a validao de
metodologias para analise de micronutrientes em farinhas de
cereais, visando garantir os teores declarados no rtulos de
produtos industrializados fortificados com vitaminas e minerais
que as utilizam como matria prima.

Implantao de um sistema de garantia da qualidade com vistas
ao reconhecimento da capacidade dos laboratrios em realizar
ensaios analticos.
Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e
Qualidade Industrial
Objetivos dos laboratrios de ensaio
alcance da proficincia tcnica desses laboratrios, baseada na
sua capacidade de operar de acordo com o proposto, alm de
demonstrar seu comprometimento.

o As caractersticas de desempenho de um mtodo so obtidas
atravs da determinao dos parmetros de validao do mtodo.
Principais parmetros: Especificidade; Seletividade; Linearidade;
Sensibilidade; Faixa de trabalho; Limite de deteco (LD) e
Quantificao (LQ), Exatido e Preciso



Objetivos do Artigo: Validar metodologias para determinao das
vitaminas B1,B2, B6 e Niacina em farinhas de cereais e analisar
amostras de farinha de trigo, milho, arroz, cevada e aveia que
so utilizadas como matria prima de produtos industrializados
fortificados com vitaminas e minerais.

Material utilizado no experimento: 12 amostras procedentes de 8
diferentes fornecedores.


Metodologia:
Extrao de vitaminas B1, B2, B6 e Niacina em uma nica etapa:




Fosfato pH 7,2
(0,228%
KH2PO4.3H2O)
dimetilformamida
(85:15)
Tampo
1mL/min
Volume de
injeo: 20 L


Fluxo
C18 fase reversa
RP-18 esfrica 5
m/125 x 4,0 mm
Pr-coluna: 5 m/
4x4 mm
Lichrospher
Coluna
Por
fluorescncia
Ex.: 368 nm;
em 440 nm
Deteco
Vitamina B1
50 mL de Soluo padro de
vitamina B1
5 mL de HCl
1 M
50,0 mg
mononitrato
de tiamina
gua
ultrapura


Diluio a fim de obter uma soluo
final de concentrao 10 g de
mononitrato de tiamina/mL.

Concentraes da curva padro, em
ng/mL: 25, 50, 100, 200 e 500.
Converso da tiamina em tiocromo:










Volume agitado em agitador de tubos e colocado em repouso por 2 min;
Adicionado 450 L de cido ortofosfrico 85%;
Soluo resfriada e o volume final completado com gua deionizada;
Injeo no cromatgrafo aps o preparo.

2 mL gua
deionizada
3 mL
ferricianeto
de potssio
Balo
volumtrico
10 mL
A cada 1 mL de
soluo padro
Meio bsico
Vitamina B2:


Fosfato pH 7,2
(0,228% KH2PO4.3H2O)
dimetilformamida
(85:15)
Tampo
1,5 mL/min
Volume de
injeo: 20 L


Fluxo
C18 fase reversa
RP-18 esfrica 5
m/125 x 4,0 mm
Pr-coluna: 5 m/
4x4 mm
Lichrospher
Coluna
Por
fluorescncia
Ex 450 nm;
Em 530 nm
Deteco
25,0 mg riboflavina,
levada fervura,
sob agitao + 70
mL gua ultrapura +
0,6 mL cido
actico glacial
Balo volumtrico
mbar de 250 mL
com gua ultrapura
Soluo final: 5 g
de riboflavina/mL
Vitamina B2










Concentraes da curva padro, em ng/mL: 6, 25, 50,125, 250, 500











Vitamina B6

Fosfato pH 2,5
(0,68% KH2PO4)
com par inico
(0,014% PIC 7) e
acetonitrila (96:4)
Tampo
Bomba 0,6
mL/min


Fluxo
C18 fase reversa
Superspher 100 RP-18
endcapped 5 m/250 x
4,0 mm
Pr-coluna: 5 m/ 4x4
mm Lichrospher 100 RP-
18
Coluna
Por
fluorescncia
Ex 296 nm; Em
390 nm
Deteco


Vitamina B6









Concentraes da curva padro, em ng/mL: 40, 80, 160,320, 800 e
1600.











Cloridrato de
piridoxol
Dicloridrato de
piridoxamina
Cloridrato de
piridoxal
Diluio em gua
ultrapura (16 g/mL)

Niacina: detectada aps reao sob UV

Fosfato pH 2,5
(0,954% KH2PO4)
em 0,76% H2O2
30 e 0,1% CuSO4
de 5 mM
Tampo
1,1 mL/min
Volume de
injeo: 20
L


Fluxo
C18 fase reversa Nucleosil
100-5 C18 m/250 x 4,0
mm
Reator: 12 m de tubulao
de tetrafluoretileno
Dimetro interno: 0,5 mm
Coluna
Por
fluorescncia
Ex 322 nm;
Em 380 nm
Deteco
Enrolada em lmpada negra que emite radiao
entre 300 a 400 nm
Niacina
As formas niacina e niacinamida foram diludas
separadamente em gua ultrapura a fim de obter uma
soluo de concentrao 16 g/mL.

Concentraes da curva padro, em ng/mL, contendo
as duas formas da vitamina PP, uma vez que os 3
vitmeros dessa vitamina foram analisados
simultaneamente: 4, 8, 16, 40, 80, 160, 800 e 1600.
Os mtodos propostos aplicam-se a matriz cereal;
A sensibilidade foi expressa como a inclinao da reta de
regresso.




Estudo da linearidade:
- Vitamina B1:

- Vitamina B2:




- Vitmeros da vitamina B6:



- Vitmeros da Niacina:



Todos os compostos apresentam-se lineares nas faixas
estudadas e a razo resposta/massa apresentada para cada
um no foi independente da concentrao em toda a faixa
estudada apenas para a vitamina B2.
A linearidade se concentra na regio onde a resposta/massa
permaneceu quase inalterada, considerando um desvio
padro de 10%. Assim, a faixa linear de trabalho para a
vitamina B2 foi definida entre 0,6 e 12 ng injetado.


Devido aos teores naturais de vitaminas B1, B2, B6 e niacina,
encontrados em farinhas de cereais, o limite inferior de
concentrao de amostra para cada faixa linear apresentou-se
muito prximo ao limite de quantificao;

Para a niacina, tanto na forma cida como na forma amida a
faixa linear no foi definida, pois os pontos de concentrao
no se apresentaram equidistantes na reta de regresso
estudada;

O valor de 20 ng de niacina injetado suficiente para
quantificar essa vitamina nas amostras propostas;


Para a avaliao da exatido dos mtodos propostos foi
utilizada a tcnica de recuperao do analito adicionado.


Resultados da variao de preciso:







Esses resultados, utilizados para definir a diferena mxima
entre os resultados de duplicata foram calculados atravs
da equao:
Limite de repetibilidade: r = 2,8 *desvio padro

As figuras a seguir
apresentam os
cromatogramas das solues
padro e das amostras de
farinha de trigo e aveia,
respectivamente, das
vitaminas B1, B2, B6 e
Niacina.



Farinha de aveia: teores naturais de vitaminas do complexo
B mais significativos. Consumida pela populao infantil em
consumo dirio de 30g de vitamina B1(24% da IDR) e
vitamina B6 (10% IDR).

Farinha de trigo: alimento fonte natural para populao
infantil em consumo dirio de 30g de vitamina B1(32% da
IDR) e vitamina B6 (13% IDR) .









Mtodos confiveis, com preciso variando entre 1 a 10%.

Dados de exatido adequados, com recuperao variando
entre 68 a 96%.

Dados de recuperao e limites de quantificao adequados
para a avaliao dos micronutrientes propostos na matriz
estudada.