Este documento describe los diferentes métodos para la determinación de carbohidratos en alimentos. Explica que los carbohidratos se pueden clasificar en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Luego describe los métodos cualitativos basados en reacciones de color y propiedades reductoras, así como los métodos cuantitativos basados en cromatografía líquida y cromatografía gaseosa para determinar los diferentes tipos de carbohidratos presentes en una muestra alimenticia.
Este documento describe los diferentes métodos para la determinación de carbohidratos en alimentos. Explica que los carbohidratos se pueden clasificar en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Luego describe los métodos cualitativos basados en reacciones de color y propiedades reductoras, así como los métodos cuantitativos basados en cromatografía líquida y cromatografía gaseosa para determinar los diferentes tipos de carbohidratos presentes en una muestra alimenticia.
Este documento describe los diferentes métodos para la determinación de carbohidratos en alimentos. Explica que los carbohidratos se pueden clasificar en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Luego describe los métodos cualitativos basados en reacciones de color y propiedades reductoras, así como los métodos cuantitativos basados en cromatografía líquida y cromatografía gaseosa para determinar los diferentes tipos de carbohidratos presentes en una muestra alimenticia.
INTRODUCCIN No todos los tipos de carbohidratos estn en todos los tipos de productos alimenticios. Las propiedades metablicas y fisiolgicas distintivas de los diferentes carbohidratos ponen de relieve el hecho de que, con fines nutricionales, no es adecuado considerar los carbohidratos como un componente nico de los alimentos. INTRODUCCIN Antes: Clculo de los carbohidratos por diferencia utilizando el sistema proximal de anlisis Sistema se dise para los piensos destinados a rumiantes, por lo que la mayor parte de los carbohidratos se digeriran en el rumen excepto la lignina-celulosa, de la cual daba una medida aproximada la fibra bruta. CLASIFICACIN EN FUNCIN AL GRADO DE POLIMERIZACIN Azcares (monosacridos y disacridos); Oligosacridos (polmeros que contienen de tres a nueve unidades de monosacridos o cido urnico); Polisacridos (polmeros que contienen ms de nueve unidades), comprendidos en dos categoras generales: -glucanos (almidones, productos de la hidrlisis del almidn y glucgeno) No -glucanos (polisacridos no amilceos [PNA], que son los principales componentes de la fibra diettica). En muchos casos un alimento contiene una gama limitada de carbohidratos y se pueden utilizar procedimientos sencillos para su anlisis (Southgate, 1991). En los Cuadros 7.6 a 7.8 se resume la gama de mtodos.
TRATAMIENTO DE MUESTRA Extraccin agua caliente (ebullicin) filtracin Determinacin de las fracciones por calefaccin hasta peso constante (70C): Soluble (monosacaridos y oligosacaridos) Insoluble (polisacaridos) Determinacin exacta de la composicin de carbohidratos: Extracto acuoso procedimientos de purificacin extraccin con ter de petrleo eliminacin de grasa y clorofilas. Clarificacin de los extractos sobre todo con medidas polarimtricas o colorimtricas eliminacin de protenas. TRATAMIENTO DE MUESTRA Clarificacin: Los metales pesados precipitan las sustancias coloidales (protenas) Los precipitados formados por accin de los metales se combinan y coprecipitan las protenas Caractersticas de los agentes clarificadores: No deben adsorber ni modificar a los carbohidratos Un exceso (razonable) de reactivo no debe interferir en la determinacin posterior La cantidad de precipitado debe ser pequea El procedimiento de precipitacin debe ser simple. TRATAMIENTO DE MUESTRA. CLARIFICACIN Agente Caractersticas Acetato de plomo neutro El ms utilizado Limitacin: Bajo poder decolorante Eliminar el exceso con sulfato sodico o fosfato Acetato de plomo bsico Actualmente sustituido por el acetato neutro de plomo Problemas si hay exceso Hidrxido de aluminio Para extractos con poco color Eficaz para flocular material coloidal Se genera por adicin de amoniaco a una disolucin de aluminio Ferrocianuro de zinc Adicin sucesiva de ferrocianuro de potasio y sulfato de zinc da lugar a la precipitacin de ferrocianuro de zinc Para extractos con poco color y muchas protenas Poco satisfactorio para extractos vegetales Eliminar el exceso de zinc por precipitacin con sosa
Carbn animal Puede absorber carbohidratos Otros Hidrxido de bario, sulfato de zinc, sulfato de cobre en medio bsico, nitrato de mercurio en medio bsico Precipitantes de protenas: acido tricloroactico y tungstato sdico DETERMINACIN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS Utilizacin de ensayos cualitativos para la determinacin de carbohidratos Basados fundamentalmente en: Reacciones de color producidas por la condensacin de los productos de degradacin de los azcares (obtenidos por tratamiento con cidos minerales fuertes) con diversos reactivos orgnicos Propiedades reductoras del grupo aldehdo (solo aldosas) Rotura del enlace adyacente al grupo hidroxilo mediante reacciones de oxidacin (formacin de formaldehdo) DETERMINACIN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS REACCIONES DE COLOR EN MEDIO CIDO FUERTE. La reaccin de un cido fuerte (HCl, H2SO4, H3PO4) sobre los carbohidratos conduce a la formacin de productos de descomposicin coloreados (despolimerizacin, ciclacin y deshidratacin) ALDOHEXOSAS HIDROXIMETIL FURFURAL
ALDOPENTOSAS FURFURAL
Coloraciones ms especficas por adicin de un reactivo (tpicamente un alcohol) al carbonilo del producto de degradacin del carbohidrato (furfural si era una aldosa) para formar un hemiacetal coloreado. Furfural Hidroximetilfurfural DETERMINACIN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS Reacciones de color en medio cido fuerte EJEMPLOS DE ENSAYOS PARA LA DETERMINACIN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS MTODOS BASADOS EN PROPIEDADES REDUCTORAS DE LOS CARBOHIDRATOS Basados en las propiedades reductoras de los monosacridos y oligosacaridos de cadena corta con el grupo aldehdo (aldosas) No son especficos Utilizar slo despus de eliminar todos los compuestos orgnicos reductores presentes en la muestra. Diversidad de reactivos y reacciones. MTODOS BASADOS EN PROPIEDADES REDUCTORAS DE LOS CARBOHIDRATOS DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CARBOHIDRATOS Determinacin cuantitativa segn Mtodos clsicos (valoraciones, fundamentalmente) Mtodos instrumentales Cromatografa Electroforesis Mtodos pticos Procedimientos bioqumicos (o enzimticos). Clasificacin de los procedimientos analticos segn analitos: Mono y oligosacridos Polisacridos nutricionales Polisacridos estructurales CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Determinacin de monosacridos y oligosacaridos Mtodos qumicos (valoracin normalmente) Colorimtricos Cromatogrficos (TLC, GC y HPLC) Electroforticos Otros mtodos pticos (polarimetra, ndice de refraccin) Bioqumicos Tendencia actual a identificar componentes individuales Separacin (por cromatografa o electroforesis) Determinacin de las fracciones por mtodos qumicos, colorimtricos, pticos, etc... Sistemas de deteccin on-line CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos qumicos Basados en las propiedades reductoras de los carbohidratos (principalmente aldosas). Volumetrias redox con diferentes tipos de reactivos valorantes oxidantes suaves (Cu2+, ferricianuro, I2, etc.) Contenido global de carbohidratos. Mtodos cromatogrficos Finalidad de la aplicacin de los mtodos cromatogrficos: Fraccionar y aislar los carbohidratos individuales Identificacin y cuantificacin individualizada En muestras de matriz compleja Tipos de cromatografa aplicados Capa fina (y papel) Cromatografa lquida Cromatografa de gases CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos cromatogrficos Cromatografa en capa fina y papel Tcnica utilizada desde hace muchos aos (1948) Determinacin cualitativa y cuantitativa Tcnica sencilla para la identificacin de carbohidratos en alimentos Necesario un tratamiento de la muestra: Precipitacin de las protenas y otros interferentes CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos cromatogrficos Cromatografa en capa fina y papel Las fases mviles ms utilizadas pueden ser: Cromatografa sobre pape (celulosa polisacrido!!) 1. n-butanol/cido actico/agua (40:10:50) 2. Piridina/acetato de etilo/agua (20:40:40) 3.Piridina/acetato de etilo/cido actico/agua (35.7:35.7:7.1:21.5) Cromatografa en capa fina (silica gel 60) 1. Isopropanol/acetato de etilo/agua (60:30:10 o 50:40:10) 2.n-butanol/etanol/agua/cido actico/piridina (6.6:66.2:19.9:0.7:6.6) 3. n-butanol/cido actico/agua (50:25:25) CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos cromatogrficos Cromatografia en capa fina y papel Sistemas de elucin con buena separacin de mono y oligosacaridos: lactosa, sacarosa, maltosa, oligosacaridos de la degradacin del almidn,... Tiempos necesarios para completar la separacin entre 18 horas y seis dias (en papel) Cuanto mayor es el peso molecular del carbohidrato en una serie homloga menor es el Rf: Rf trisac < Rf disac < Rf monosac Rf hexosas < Rf pentosas Rf aldosas < Rf cetosas CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos cromatogrficos Cromatografa en capa fina y papel Ejemplos de reveladores CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos cromatogrficos. Cromatografa de Gases (GC) Tcnica con muy buena resolucin y sensibilidad pero es necesario realizar una etapa de derivacin para proteger los grupos hidroxilo as como los grupos reductores de los carbohidratos Analitos no voltiles derivacin qumica: Metilacin Acilacin Trimetil sililacin Derivados de butilborato Los cromatogramas son ms simples si se realiza una reduccin de los monosacridos a polioles antes de la derivacin. CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos cromatogrficos Cromatografa Lquida (LC) La tcnica cromatogrfica que presenta mayores ventajas desde el punto de vista experimental Simplicidad (poco tratamiento de muestra y rapidez) No requiere la aplicacin de procedimientos de derivacin Versatilidad elevado nmero de fases estacionarias. Inicios problemas baja estabilidad de las fases estacionarias polares tiempos de vida de las columnas muy bajos. Actualidad ha mejorado fases estacionarias mucho ms estables. Detector ms ampliamente utilizado en este tipo de determinaciones: ndice de refraccin. CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos pticos Refractometra Muy habitual en el anlisis de carbohidratos para determinar el contenido en slidos disueltos (jarabes, siropes, ) Uso de tablas con concentraciones de sacarosa en funcin del ndice de refraccin (a 20 C) y correccin de temperatura Control y anlisis de rutina Polarimetra Los carbohidratos son pticamente activos y producen una rotacin ptica de la luz polarizada que se puede medir Polarmetro visual: mide el ngulo de rotacin sobre una escala circular. Luz monocromtica. Sacarmetro: diseado para medir la rotacin ptica de muestra expresada en porcentaje de sacarosa. Luz blanca y filtro monocromador. Espectro polarmetros fotoelctricos: alta precisin, utilizan clulas fotoelctricas para la medida final. CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos pticos Espectroscopia infrarroja Complicada de aplicar a carbohidratos sencillos: Muy poco solubles en disolventes orgnicos se deberan disolver en agua problema con el material del soporte de las muestras (KBr, tambin muy soluble en agua) Uso de pastillas de KBr (muestra slida!!). CUANTIFICACIN DE MONO Y OLIGOSACARIDOS Mtodos bioqumicos Clasificados en dos grupos: Microbiolgicos Utilizan fermentos (levaduras) con diferente capacidad de fermentacin: tiles para diferenciar, por ejemplo, pentosas y hexosas Enzimticos Rotura estereoselectiva de los oligosacridos para, a continuacin, determinar selectivamente los monosacridos formados CUANTIFICACIN DE POLISACRIDOS Determinacin del almidn en alimentos Diferentes mtodos pero siempre hay que empezar por una extraccin y dispersin del almidn en una solucin coloidal
Anlisis final por precipitacin y determinacin gravimtrica Mtodos enzimticos de determinacin de la glucosa despus de la hidrlisis selectiva del polisacrido (a-amilasa y amiloglucosidasa)