Marcaje molecular por sonda.

Presenta: Elier soto.

Objetivos de aprendizaje
Explica los procedimientos para el marcaje
de fragmentos de DNA utilizando la
tecnologa de PCR.
Reconoce los tipos y caractersticas de
sondas moleculares y los fundamentos del
marcaje, asi como la importancia de su
utilizacin.
Conoce y explica generalidades de
diferentes mtodos de marcaje.

Errores mas frecuentes.

La mala traduccin de algunos libros de
textos, tienden a cambiar la idea general de
los conceptos.
Confundir las tcnicas de los distintos tipos
de marcaje molecular.
No saber de donde proviene el fragmento
de Klenow.
Casarse con la idea de que solo existe un
solo tipo de marcaje de DNA por sonda
Qu es una sonda de DNA?

Son molculas de DNA de cadena sencilla
marcadas mediante radiacin o agentes
qumicos, con el fin de ser utilizadas para la
deteccin de secuencias complementarias
de DNA.
Importancia.
La capacidad de encontrar en un genoma
las secuencias de DNA de interes mediante
sondas especificas siendo usado
principalmente en el campo de la medicina.

marcaje de fragmentos de DNA
utilizando la tecnologa de PCR.

Se usan nucleotidos modificados con
moleculas fluorescentes o atomos
radiactivos (la molecula fluorescente solo
debe de fijarse a la base de uno de los
cuatro nucleotidos usados como
precursores en la sintesis de DNA)
Los nucleotidos se marcan radiactivamente
con 32P y el 35 S.


Tambien se pueden marcar los nucleotidos
con biotina o dixogigenina
marcaje de oligonucleotidos de DNA, para ser
Usados en la macarcion de sondas por la
la tecnologa de PCR.
oligonucleotidos degenerados.
MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
EN EL EXTREMO 3


SE MARCAN USANDO LA ENZIMA
TERMINAL DEOXINUCLEOTIDO
TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA
ISOTOPOS RADIACTIVOS DE P-32 EN
EL EXTREMO 3
Marcacin de oligonucleotidos
con TdT
MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
EN EL EXTREMO 5




SE MARCAN USANDO LA ENZIMA
POLINUCLEOTIDO CINASA QUE
AGREGA UN SOLO FOSTATO DE P-32
EN EL EXTREMO 5 DE CADA CADENA
DE DNA
RNAm
cDNA
Plantilla para PCR
oligonucleotidos
Degenarados marcados
PCR
RT-PCR
Sondas DNA marcadas.
SONDAS MOLECULARES
CONVENCIONALES.
SONDAS.
DNA.
RNA.
Sondas convencionales, DNA
obtenido por clonacion celular.
EXTRACCION DEL DNA
PLASMIDICO

RESTRICCION DEL
INSERTO

DESNATURALIZACION
DEL DNA
Sondas convencionales, RNA obtenido
por clonacin celular.
Marcaje
de
sondas
Mtodo
Directo.
Mtodo
Indirecto.
El marcador se detecta
unido a la sonda.
El marcador para poderse
Detectar debe unirsele una
Proteina detectora.
MARCAJE DE SONDAS,
METODO INDIRECTO
Generalidades de diferentes tipos de
marcaje.
NICK TRANSLATION.

RANDOM PRIMER EXTENSION.

MARCAJE TERMINAL POR RELLENO.

MARCAJE DE OLIGONUCLEOTIDOS, descrito
en marcaje de fragmentos de DNA utilizando
PCR, se usa un nucleotido marcado con
32Pd NTP, -35Sd NTP.
Marcacin de SONDAS
NICK trasnlation.

ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y
DNApolimerasa 1

SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA

SE INTRODUCE LA MELLA AL AZAR MEDIANTE
LAS DNAasas.

PUEDEN HACERSE SONDAS NO RADIACTIVAS



NICK TRANSLATION.
Marcacin de SONDAS
RANDOM PRIMER

SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE
OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA.

SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA
POR CALOR).

SE USA EL FRAGMENTO DE KLENOW PARA
GENERAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA

Metodo de cebador al azar
Marcaje terminal por relleno
Bibliografia.
Biologia celular y molecular. Lodish, Berk,
Zipursky, 4ta. Edicion, editorial
panamericana.

Biologa molecular e Ingeniera Gentica.
Luque, Jos ngel. ; Editorial Harcourt.