MICROSCPIO

M.O.C.
M.O.C.(microscpio ptico composto)
Funciona com um conjunto de lentes (ocular e
objectiva) que ampliam a imagem.
Iluminao artificial
constitudo por uma parte mecnica que
suporta e permite controlar uma parte ptica
que amplia as imagens.

A parte mecnica serve para dar estabilidade e suportar a

parte ptica. Esta parte constituda por:
P ou Base suporta o microscpio, assegurando a sua estabilidade.
Brao ou Coluna pea fixa base, na qual esto aplicadas todas as outras
partes constituintes do microscpio.
Tubo ou Canho cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se
na extremidade superior a ocular e na inferior o revlver com objectivas.
Platina pea circular, quadrada ou rectangular, paralela base, onde se
coloca a preparao a observar, possuindo no centro um orifcio circular ou
alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo
condensador.
Parafuso Macromtrico engrenagem que suporta o tubo e permite a sua
deslocao a da platina. indispensvel para fazer a focagem.
Parafuso Micromtrico imprime ao tubo ou platina movimentos de
amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorara a
profundidade de campo do microscpio.
Revlver disco adaptado zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro
objectivas de diferentes ampliaes: por rotao possvel trocar rpida e
comodamente de objectiva

A parte ptica constituda por:

Sistema de Oculares e Sistema de Objectivas o
conjunto de lentes que permitem a ampliao do objecto.
A ampliao dada ao microscpio igual ao produto da
ampliao da objectiva pela ampliao da ocular.

Fonte Luminosa existem vrios tipos de fontes

luminosas, podendo ser uma lmpada (iluminao
artificial), ou um espelho que reflicta a luz solar
(iluminao natural).
Condensador distribui regularmente, no campo visual
do microscpio, a luz reflectida pelo espelho.
Diafragma regula a intensidade luminosa no campo
visual do microscpio.

Limites de resoluo

Poder Resolvente
O poder de resoluo traduz a capacidade de
distinguir com nitidez dois pontos muito prximos.
A distncia mnima a que esses pontos devem estar para
que o microscpio ainda tenha poder de resoluo,
chama-se limite de resoluo.
Assim se duas partculas tm entre si uma distncia de
0,4 m, no microscpio vo aparecer individualizadas,
mas vista desarmada aparecero fundidas como se de
uma s partcula se tratasse.
O micrmetro 1000 vezes inferior a um milimetro.
Deste modo, o poder ampliador no deve ser
considerado como a melhor qualidade de um sistema
ptico. Uma boa objectiva deve apresentar alm de tudo
um grande poder de resoluo, pois prefervel ter uma
imagem menos ampliada mas mais ntida do que a
situao inversa.

PREPARAES
Em microscopia ptica as preparaes podem ser temporrias ou
definitivas, se apresentam, respectivamente, curta ou longa durao.
Nas nossas aulas de microscopia, s realizaremos preparaes do
primeiro tipo.
As preparaes temporrias permitem fazer a observao de clulas
no seu meio normal de vida: gua salgada, gua doce, soro
fisiolgico ou plasma sanguneo.
Por vezes, no estudo de microrganismos e de tecidos animais ou
vegetais, temos necessidade de observar o material in vivo (ao
vivo), no seu estado natural, sem uso de fixadores ou corantes que
de algum modo sempre criam algo de artificial no material da
observao.
A preparao temporria tem uma durao curta, isto porque pode
ocorrer evaporao de meio aquoso, acompanhada de um processo
de degradao da clula decomposio e autodestruio
autlise.

Tcnicas para realizar preparaes temporrias

O material a observar
colocado entre a lmina e
a lamela: segurando a
lamela, com a ajuda de
uma agulha de disseco,
de modo a que ela faa
um ngulo de 45 com a
lmina, deixa-se cair
lentamente.
Esta tcnica pode ser
considerada como um
complemento de outras.

Tcnica do esfregao
uma tcnica que permite a
separao de clulas em meio
lquido.
onsiste em espalhar um fragmento
de tecido ou de uma colnia sobre
uma lmina de vidro, o que provoca
a dissociao de alguns elementos
celulares e a sua aderncia ao vidro.
Forma-se assim uma fina camada de
clulas, facilitando a observao.
Este mtodo usado na observao
de sangue e outros lquidos
orgnicos, em que se coloca uma
gota do lquido sobre uma lmina, e
com a ajuda de uma outra lmina ou
lamela se espalha bem. Depois de
seco o material pode ser corado e
fixado

Tcnica do esmagamento
Este mtodo usado nos casos em
que existe uma aderncia fraca
entre as clulas do tecido a
observar.
Para visualizar as clulas, basta
colocar um pequeno fragmento do
tecido entre a lmina e a lamela e
fazer uma pequena presso com o
polegar.
Provoca-se
assim
um
esmagamento do tecido, o que faz
com que as clulas se espalhem,
formando uma fina camada, que
facilmente atravessada pela luz.
(Ex.: Polpa de Tomate)

Tcnica de cortes finos

uma tcnica mais complexa e frequentemente usada em
histologia. Consiste em cortar o material biolgico em finas
camadas, susceptveis de serem atravessadas por raios
luminosos.
Foi a tcnica utilizada por Hooke na observao da cortia e
utiliza-se sempre que se pretende discernir por
transparncia os pormenores da estrutura celular de um
rgo ou tecido que no possvel com a tcnica de
esmagamento (pois altera a ordem das clulas).
Contudo, deve-se ter em conta que se est a observar uma
fina camada de uma clula ou organelo e que a realidade
tridimensional pode ser muito diferente.
A fim de se obter cortes de espessura regular e finos usa-se
um aparelho denominado micrtomo. O material a cortar
inserido em medula de sabugueiro e o conjunto incluso no
cilindro central oco do micrtomo de Ranvier. Para
microscopia ptica fazem-se cortes de 5 a 12m.

Com algum treino e percia possvel obter cortes de

boa qualidade para microscopia ptica usando
simplesmente uma lmina afiada

Micrtomo de mo improvisado:
Realiza-se uma inciso longitudinal sobre um
pequeno fragmento de medula de sabugueiro ou
de uma rolha de cortia.
Na inciso introduz-se o material biolgico a
submeter a corte.
Aperta-se com um fio todo o conjunto, apara-se
o material que vai para alm de face de corte e
fazem-se cortes o mais finos possvel.

Colorao
Para realizar preparaes temporrias utilizam-se
corantes vitais porque podem ser usados em clulas
vivas sem as matarem.
Esto em concentraes muito baixas (0,01%), a fim de
diminuir a toxicidade nas clulas.
Os corantes podem ser vitais ou no vitais, conforme
permitam colorar clulas vivas e mant-las assim ou no.
O mesmo corante pode ser vital ou no, dependendo da
concentrao em que se encontra.
Ex.: Azul de metileno pode ser um corante vital se estiver em
baixa concentrao.

A colorao das clulas deve-se sobretudo combinao

dos corantes com as protenas, dependendo portanto da
sua carga elctrica e pH.
Por esta razo, o facto de os corantes poderem corar
especificamente um organelo e no outro (corantes
selectivos) est relacionado com a diferena de cargas
elctricas existente entre as protenas dos diferentes
organelos
celulares, tendo os corantes uma
especificidade para determinada carga elctrica ou pH,
que permita atraco pelo seu prprio e que ocorram
ligaes qumicas.

Corantes selectivos:

Tcnicas de colorao
Na tcnica de colorao
por imerso o material
biolgico fica imerso
durante alguns minutos
no corante seleccionado

 Na tcnica de colorao
por irrigao substituise o meio de montagem
de uma preparao j
efectuado por outro, que
neste caso o corante

Vantagens do uso de preparaes temporrias:

A quantidade de artefactos que pode ser produzida muito
reduzida.
Possibilita a visualizao de material biolgico in vivo, no seu
estado natural.
Desvantagens do uso de preparaes temporrias:
As preparaes no se conservam por muito tempo, mesmo
quando se empregam lquidos conservantes; passado algum tempo
comeam a aparecer sinais de degenerescncia, acabando com a
morte do material biolgico.
Apenas se pode aplicar a material suficientemente transparente.
As clulas grandes ou bastantes frgeis apresentam, por vezes
artefactos devido ao peso da lamela.
No se pode observar no microscpio electrnico.

PREPARAES DEFINITIVAS
Embora seja possvel o estudo microscpico de clulas vivas, muitas vezes
h vantagem em obter uma preparao definitiva, na qual as clulas
fiquem preservadas, isto , fixadas e coradas para melhor demonstrao
dos seus componentes, permitindo posteriores observaes
Vantagens e desvantagens do uso de preparaes definitivas

Etapas de realizao de preparaes definitivas

1. Colheita - Obteno do material que se pretende
observar
2. Fixao - Paragem rpida de toda a actividade
vital, estabilizando a estrutura. Tem como
objectivos conservar o mais possvel a estrutura
que se apresentam enquanto viva, impedindo a
aco das enzimas autolticas. So utilizados
fixadores como o lcool, cido actico, cido
smico, mistura de lcool e ter em partes iguais,
lquido de Carnoy e lquido de Bouin (fixador
universal). Esta etapa tambm pode ser conseguida
atravs de agentes fsicos: por congelao,
embebendo a pea num banho frio (por exemplo,
azoto lquido de 160 a 190C). Seguidamente
procede-se remoo dos cristais de gelo,
introduzindo a pea no vcuo a temperaturas
baixas. No vcuo o gelo sublima e o vapor de gua
removido

3. Desidratao - Consiste na eliminao

de gua da pea que se est a preparar.
Utiliza-se uma srie de lcoois de
graduao crescente at ao lcool
absoluto, passando finalmente pelo
xido de propileno
4. Incluso - O material mergulhado em
banho de parafina fundida que o reveste
completamente e penetra em todas as
suas cavidades. Nestas condies
mantido na estufa durante cerca de 24
horas temperatura de 56C. Obtm-se,
por arrefecimento da parafina, um bloco
que tem includa a pea, podendo ser
posteriormente submetida ao corte. A
parafina e a gua no so miscveis. Em
substituio da parafina podem utilizarse outras substncias como gelatina,
araldite, etc.

5. Corte - Os cortes da pea includa no

bloco devem ser finos, de poucos
micrmetros de espessura, utilizandose, para isso, aparelhos especiais os
micrtomos .
6. Colagem - Consiste em fazer aderir
o corte lmina. Para isso coloca-se a
lmina em placa aquecida (40C).
Sobre ela coloca-se uma gota de gua
albuminada e o corte, que se distende
com o auxlio de uma agulha. Com
papel de filtro absorve-se a gua em
excesso. Vai para a estufa a 40C
durante 24 horas.

7. Desparafinao e Hidratao Eliminao de toda a parafina que

serviu para realizar o corte. obtida
atravs de banhos de xilol.
Seguidamente o xilol retirado,
introduzindo a pea numa srie de
banhos em lcool de graduao
decrescente.
8. Colorao - Os cortes so
introduzidos nos corantes, que vo
permitir uma viso diferenciada das
vrias partes da preparao.Os
corantes so substncias qumicas
que necessitam de gua para se
poderem ligar quimicamente a
determinadas estruturas celulares

9. Desidratao - Eliminao da gua da

pea que estamos a preparar. Utiliza-se a
tcnica de banho numa srie de lcoois
de graduao crescente.
10. Montagem - O material colocado
em condies de poder ser observado ao
microscpio. Como meio de montagem
pode utilizar-se uma resina como o
blsamo-do-canad.
Cobre-se
a
preparao com uma lamela, evitando a
formao de bolhas de ar. O blsamo
solidifica, fazendo aderir entre si a
lmina e a lamela. A secagem do blsamo
lenta e demora, por vezes, uns dias (em
estufa, trs dias).

Plano de Actividade Experimental n. 1: Caractersticas da Imagem em

Microscopia ptica.
Procedimento:
Material:
gua
Tesoura
3 lminas
3 lamelas
Conta-gotas
Papel branco
Lpis
Agulha de disseco
M.O.C.

Num fragmento de papel, desenhe a letra A e

coloque-o numa lmina.
Com o auxlio de um conta-gotas, deite uma gota de
gua sobre o fragmento de papel.
Com a ajuda de uma agulha de disseco cubra o
fragmento com uma lamela, de acordo com a tcnica
de montagem.
Com a letra A na posio real, coloque a preparao
sobre a platina do microscpio de modo a ocupar o
centro do orifcio desta.
Observe a preparao utilizando a objectiva de menor
poder ampliador.
Desenhe a imagem da letra obtida na ocular.
Com o auxlio dos polegares, movimente suavemente
a preparao para a direita e para a esquerda, para
cima e para baixo, anotando a sentido do movimento
da imagem atravs da ocular.
Repita os passos anteriores utilizando as letras E e P,
respectivamente.

 Coloca a letra sobre uma

lmina e em seguida, com o
auxlio de um conta-gotas,
deita uma gota de gua sobre a
letra.
Deixa o papel absorver a gua
e cobre com a lamela.
Segura a lamela de modo a que
ela faa um ngulo de cerca de
45 com a lmina e deixa-a
cair lentamente, se necessrio
ajudando com uma agulha de
disseco, de modo a no
deixar ficar bolhas de ar.

Questes:
1. A letras P,E e A quando observadas atravs do
microscpio, aparecem com a mesma orientao do que
quando observada sem o microscpio?
2. Faz um esquema das letras quando colocadas no
microscpio.
3. Se moveres a preparao para a direita, em que direco
se parece deslocar a imagem vista ao microscpio?
4. O que acontece imagem observada quando trocas de
objectivas?

IMAGEM FORNECIDA PELO MOC

A imagem fornecida pelo
microscpio ptico composto
ampliada, invertida e virtual.
O sistema de objectivas
fornece uma imagem
ampliada, invertida e real
(AB).
A ocular actua sobre a imagem
obtida pela objectiva
fornecendo um imagem
ampliada, direita e virtual
(AB).

RELAO ENTRE A REA OBSERVADA E A

AMPLIAO UTILIZADA
A rea do material observado varia na razo inversa da
ampliao que se utiliza. Deste modo, pode-se relacionar a
rea da superfcie com as ampliaes atravs da relao:

A 1 ampliao mnima A 2 ampliao mdia

Plano de actividade experimental n. 2: Profundidade do campo

microscpico
Material:
gua
Tesoura
Lmina
Lamela
Conta-gotas
2 cabelos
Agulha de disseco
M.O.C.

Procedimento:

1.
Entre a lmina e a lamela, faa uma
montagem aquosa de dois cabelos de cores
diferentes.
2.
Com a objectiva de menor ampliao,
foque e observe os fragmentos de cabelo no
local do cruzamento de dois fios.
3.
Utilizando as restantes objectivas, repita
a operao anterior e tente, se possvel, foclos em simultneo.
4.
Interprete os resultados obtidos.

Concluso:

A profundidade de campo uma caracterstica do

microscpio ptico que se refere ao facto de no ser
possvel focar dois planos diferentes, simultaneamente.
Assim, ao focarmos um plano desfocamos o outro e viceversa.
Considerando que o material biolgico tridimensional,
quando observamos uma preparao de uma infuso, por
exemplo, temos de ter em ateno que podemos estar a
focar um plano no qual estejam poucos ou nenhum
microrganismo, e estes estarem a movimentarem-se noutro
.

Plano de actividade experimental n. 3: Relao: ampliao

utilizada/ rea real observada.
Material:
gua
Tesoura
3 lminas
3 lamelas
Conta-gotas
Papel milimtrico
Agulha de disseco
M.O.C.

Procedimento:
1.

2.
3.

4.
5.
6.

7.

Corte um pequeno quadrado (5 a 8mm) de papel

milimtrico e, com as quadrculas voltadas para cima,
monte-o entre a lmina e a lamela, humedecendo-o
previamente com o auxlio de um conta-gotas.
Coloque a lmina na platina de modo a que o quadrado
de papel fique no centro do orifcio desta. Com a objectiva de
menor ampliao proceda respectiva focagem.
Observando pela ocular, faa coincidir uma das linhas de
quadrculas com o dimetro do campo do microscpio.
Com base no nmero de quadrculas, e sabendo que o
valor de cada um dos seus lados de 1 mm, proceda
medio do dimetro desse campo.
Calcule a rea dessa superfcie, com base na frmula
rea=r2, onde r o raio.
Repita as operaes realizadas nos passos 3 a 5 utilizando
a objectiva de mdia ampliao.
Com base nas dimenses reais de cada uma das reas que
observou e calculou, procure estabelecer uma relao com o
respectivo poder ampliador.

Resultados e Discusso
Clculos:
Utilizando os resultados obtidos na
aula prtica vamos calcular as reas
dos campos microscpicos obtidos
com as seguintes ampliaes:
a1= 5 x 15 = 75x
a2= 10 x 15 = 150x
Para cada uma das ampliaes, foram
estimados os seguintes dimetros:
d1= 2,4 mm
d2= 1,2 mm
Por conseguinte, as reas dos campos
microscpicos respectivos, so as
seguintes:
rea1= 3,14 x 2,42 = 18,1mm2
rea2 = 3,14 x 1,22 = 4,5 mm2

Concluses:
A rea observada varia na razo inversa da ampliao que se utiliza.
Por isso, ao ampliar uma imagem reduz-se a rea observada.
Existe uma relao de variao inversa entre a ampliao utilizada e
o dimetro do campo microscpico, que a seguinte:
a2/a1=d1/d2

Em que:

a1 ampliao da objectiva 1
a2 - ampliao da objectiva 2
d1 dimetro do campo observado com a objectiva a1
d2 - dimetro do campo observado com a objectiva a2

Consideraes gerais:
A montagem de grandes fragmentos para observar ao
microscpio desnecessria, pois materiais de
dimenses superiores rea do campo microscpico no
so por ele abrangidos.
Devemos iniciar a observao com a objectiva de menor
ampliao: a rea observada maior e podemos captar
uma imagem geral do que queremos observar. Depois
centramos a zona que queremos ampliar e trocamos de
objectiva.
Saber as medidas do dimetro e da rea observada no
m.o.c. permitir-nos- calcular um valor aproximado do
tamanho de microrganismos observados.