Unibh

Curso: Biomedicina
Disciplina: Anlise Bromatolgica

Protenas
Prof Dr Tnia Maria Leite da Silveira

PROTENAS
DEFINIO

Substncias orgnicas complexas (C, H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn)

Polmero de alto peso molecular

Unidade bsica: aminocidos

IMPORTNCIA
nutricional
propriedades sensoriais

PROTENAS
FUNES DAS PROTENAS

Catlise enzimtica

Transporte e armazenamento (hemoglobina, mioglobina,

lipoprotenas)

Movimento coordenado (miosina, actina, tropomiosina)

Sustentao mecnica (colgeno, elastina, queratina)

Proteo imunolgica (imunoglobulinas)

Gerao e transmisso de impulsos nervosos (protena receptoras)

Controle do metabolismo e do crescimento (hormnio do

crescimento, insulina, fatores de crescimento)

AMINOCIDOS

PROTENAS (aa)
AMINOCIDOS
Unidades estruturais bsicas das protenas

AMINOCIDOS (AA)
Cada aminocido tem uma cadeia lateral (R) caracterstica, que
influencia suas propriedades fsico-qumicas.

Diferenas: tamanho, estrutura e carga eltrica.

Arranjo tetradrico atividade tica ismero L e D
S os aminocidos L so constituintes de protenas naturais.

AMINOCIDOS (AA)
Apolares ou hidrofbicas, exemplos:

alanina

valina

leucina

triptofano

fenilalanina

metionina

AMINOCIDOS (AA)
Polares ou hidroflicos, exemplos:
tirosina

serina

asparagina

cido asprtico

glicina

cido glutmico

histidina

AMINOCIDOS (AA)
Propriedade fsicas dos aminocidos:

Slidos incolores, cristalinos, que se fundem a alta temperatura

Podem ser inspidos, ter sabor doce ou amargo

Solveis em gua e insolveis em solventes orgnicos

So compostos anfteros (zwitterions)

H3N+ CHR COOH

pH
cido

H3N+ CHR COO-

pH
neutro

H2N CHR COO-

pH
bsico

PROTENAS

PROTENAS
Protenas so polmeros de aminocidos.
Vinte diferentes tipos de aminocidos ocorrem naturalmente

nas protenas.
Protenas diferem: com o tipo, nmero e seqncia de
aminocidos na cadeia polimrica, conformao molecular
tridimensional.
Apresentam de 50-55% de C, 20-23 % de O, 14-18 % de N,

6-8% de H, 0-4 % de S.

PROTENAS
ESTRUTURA DAS PROTENAS

ESTRUTURA PRIMRIA
Seqncia linear de aminocidos
Nvel estrutural mais importante, porque dele deriva todo o
arranjo espacial da molcula
Varia em 3 aspectos: nmero, seqncia e natureza dos AA

PROTENAS
ESTRUTURA SECUNDRIA
Disposio espacial adotada pela cadeia polipeptdica
Estrutura helicoidal (-hlice) interaes H intra-moleculares
Estrutura foliar (folhas pregueadas) interaes H intermoleculares

PROTENAS
ESTRUTURA TERCIRIA
Organizao tridimensional da cadeia polipeptdica contendo ou
no zonas de estrutura secundria definidas

Estabilizao:
Ligaes dissulfeto (Cys + Cys = cistina)
interaes de hidrognio
Interaes eletrostticas
Interaes dipolares
Interaes hidrofbicas
Foras de Van der Waals
Grupos hidrofbicos dispostos no interior da molcula

PROTENAS
ESTRUTURA QUATERNRIA
Resultado de associaes no covalentes de unidades proticas
iguais ou diferentes
Estas subunidades se mantm unidas por foras covalentes, como
pontes dissulfeto, e ligaes no covalentes, como pontes de
hidrognio, interaes hidrofbicas, etc.

PROTENAS
DESNATURAO PROTICA

Modificao da conformao protica, sem que haja ruptura das

ligaes peptdicas.
Pode ser reversvel ou irreversvel.
Efeitos:
Reduo da solubilidade.
Alterao da capacidade de fixao de gua.
Perda da atividade biolgica (enzimas).
Aumento da susceptibilidade ao de proteases.
Aumento da viscosidade.

PROTENAS
AGENTES DESNATURANTES:

Fsicos: temperatura, presso hidrosttica, agitao, irradiao,

ultravioleta, ultra-som.

Qumicos: pH, solventes orgnicos, solutos orgnicos (uria,

cloreto de guanidina), detergentes, sais (desestabilizao das
interaes hidrofbicas), metais.

PROTENAS
PROTENAS
DESNATURAO VANTAJOSA
Inativao de microrganismos patognicos e deterioradores.
Inativao de enzimas (lipases, proteases, lipoxigenases).
Queijos: sabor amargo (protelise)
Inativao de fatores anti-nutricionais (inibidores de tripsina, em
feijo, soja) e protenas txicas ou alergnicas.

Queijo, iogurte: reduo da solubilidade coagulao protica

textura desejada.
Aumenta digestibilidade protica e biodisponibilidade de AA.

PROTENAS
PROTENAS
DESNATURAO DESVANTAJOSA
Coagulao protica em leite UHT
Perda de atividade biolgica (imunoglobulinas)
Exposio de grupos reativos (SH) sabor de leite cozido

PROTENAS
PROTENAS
Aspectos a serem considerados:
Composio da protena
Digestibilidade
Biodisponibilidade dos aminocidos essenciais
Ausncia de toxicidade e/ou propriedades antinutricionais
Protena de alta qualidade
Contm todos os aminocidos essenciais.
Digestibilidade comparada ou melhor do que as protenas da
clara do ovo ou as protenas do leite.
Protenas de origem animal so melhores do que protenas de
origem vegetal.
Cereais (arroz, trigo, milho, cevada) Met, Lys
Leguminosas (feijo, soja) Met, Lys

PROTENAS NO ALIMENTO
Fonte de aminocidos na dieta e fonte de energia.
Contm aminocidos essncias, como lisina, triptofano,

metionina, leucina, isoleucina e valina, que no podem ser

sintetizados pelo organismo humano.

Protenas alimentares so digerveis, no txicas e palatveis.

Protenas tm diferentes estruturas moleculares, atributos

nutricionais e propriedades fsico-qumicas.

PROTENAS - PRINCIPAIS FONTES

Tabela: Contedo de AA essenciais de vrias fontes (mg/g protena)
FONTE PROTICA

[AA]
mg/g Ptn

Ovo

Leite

Carne

Trigo

Arroz

Milho

Soja

His

22

27

34

21

21

27

30

Ile

54

47

48

34

40

34

51

Leu

86

95

81

69

77

127

82

Lys

70

78

89

23

34

25

68

Met + Cys

57

33

40

36

49

41

33

Phe + Tyr

93

102

80

77

94

85

95

Thr

47

44

46

28

34

32

41

Trp

17

14

12

10

11

14

Val

66

64

50

38

54

45

52

Total

512

504

480

336

414

422

466

Fonte: adaptado de FENNEMA (1996)

PROTENAS
Responsveis por compostos aromticos e substncias coloridas
formadas por reaes trmicas ou enzimticas ocorridas durante
obteno, preparao e armazenamento dos alimentos.
Componentes
freqentemente

estruturais

de

determinam

muitos
sua

alimentos

textura,

por

naturais,
exemplo,

tenderness de produtos de carne e peixe.

Isoladas so usadas nos alimentos como ingredientes devidos a
suas propriedades funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir
aparncia, textura ou estabilidade desejveis ao produto:
agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e espessantes.

Propriedades funcionais de protenas

Propriedades de hidratao: dependem das interaes com a gua.
Absoro e reteno de gua, molhabilidade, formao de gel,
adesividade, dispersibilidade, solubilidade e viscosidade.
Propriedades relacionadas com interaes entre protenas:
formao de gel, coagulao, formao de estruturas como fibras
e glten.
Propriedades de superfcie: emulsificao, formao de espuma,
formao de pelculas.

Alimento

Funcionalidade

Bebidas

Solubilidade em diversos valores de pH, estabilidade

trmica, viscosidade.

Sopas, molhos

Viscosidade, emulsificao, reteno de gua.

Produtos de
panificao

Matriz e filme com propriedades viscoelsticas, coeso,

desnaturao trmica, formao de gel, absoro de gua,
emulsificao, aerao.

Derivados de leite
(sorvetes, iogurtes)

Emulsificao, reteno de gordura, viscosidade, aerao,

formao de gel, coagulao.

Produtos crneos
(embutidos,
presunto)

Emulsificao, gelificao, coeso, absoro de gua e

gordura, reteno de gua.

Coberturas

Coeso e adeso.

Substitutos dos ovos

Aerao, formao de gel.

Produtos de
confeitaria

Dispersibilidade, emulsificao.

Glten

Glten

Reao de Maillard
Foi descoberta por Louis Camille Maillard.
reao entre carboidratos (acares) e protenas (aminocidos), e
responsvel por mudanas de cor, flavor e mudanas no valor
nutritivo de alimentos.
A reao de Maillard ocorre por trs passos: incio formao de N
glicosdio.

2. Reao de Amadori (rearranjo de Amadori ) - isomerizao, forma compostos

chamados cetosaminas

3. Cetosaminas so desidratadas e por fisso os produtos formados so diacetil, acetol,

ou piruvaldedo degradao de Strecker.

MTODOS FISICO-QUMICOS DE DETERMINAO DE

PROTENAS EM ALIMENTOS

IMPORTNCIA

Conhecer o valor nutritivo

Determinao da composio centesimal de um alimento
Estimar rendimento industrial
Avaliar a qualidade (ex.: glten qualidade da farinha)
Avaliar a influncia nas propriedades sensoriais

MTODOS DE DETERMINAO
A. Mtodos que utilizam a determinao de Nitrognio:
Kjeldahl **
Dumas **
Destilao direta
Mtodos que utilizam tcnicas nucleares: ativao por nutrons; ativao
por prtons
B. Mtodos qumicos e fsicos
Reao do Biureto **
Interao protena-corante (Dye-binding) **
Mtodo do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Mtodo do fenol reagente **
Titulao com formol
Espectroscopia no IV ou no UV **
Refratometria
Turbidimetria **
Espectroscopia eletrnica
Polarografia

Anlise de nitrognio
a determinao mais utilizada.
Considera que as protenas tm 16% de nitrognio em mdia.
Fator geral (F) na transformao de nitrognio para protenas de
6,25%.

%Proteinas = F x %N
Este fator de converso (F) d erros quando o contedo em N
muito diferente de 16%. Nesses casos, existem os fatores de
converso especficos:
Trigo: 5,70 ;

leite: 6,38 ;

gelatina: 5,55

Protenas - Kjeldahl

Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl.

O alimento digerido com cido forte, liberando nitrognio o qual
ser determinado por titulao.

A quantidade de protenas presentes calculada a partir da

concentrao de N no alimento.
O mtodo Kjeldahl dividido em trs etapas: digesto, destilao
e titulao.

Mtodo Kjeldahl
Digesto
O alimento colocado no frasco de digesto e ento digerido pelo
aquecimento na presena de cido sulfrico (um agente oxidante
que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selnio, titnio ou
mercrio).

A digesto converte o nitrognio do alimento (ou outro na forma

de nitratos ou nitritos) em amnia, e a matria orgnica em C02 e
H20. O gs amnia no liberado numa soluo cida porque a
amnia est na forma de on (NH4+) que se liga ao on sulfato
(SO42-) e assim permanece na soluo:

CHON (alimento) (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1)

Mtodo Kjeldahl
Neutralizao e destilao
Depois da digesto o frasco de digesto conectado no destilador
de nitrognio. Adiciona-se hidrxido de sdio, que converte o
sulfato de amnio em gs amnia:

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)

A amnia formada liberada da soluo. Por destilao por arraste
a vapor a NH3 transferida do frasco de digesto para um
erlenmeyer contendo cido brico em excesso.

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3- (on borato) (3)

DESTILADOR
NaOH

DIGESTOR
gua de
arraste
Amostra

Erlenmeyer com
soluo de H3BO3

Mtodo Kjeldahl
Titulao
O contedo de N estimado por titulao do borato de amnio
com cido sulfrico ou clordrico.

H2BO3- + H+ H3BO3 (4)

A concentrao dos ons H+ gastos na titulao equivalem
concentrao do nitrognio.

O contedo de N ento convertido em protenas usando um

fator apropriado:
%Protein = F x %N

digesto
destilao

Falhas do processo (Kjeldahl):

1. No uma medida verdadeira de protenas, dosa todo N protico e no protico (purinas, piridinas, vitaminas, uria,
aminas, amidas, etc.).
Pode melhorar a tcnica precipitando a protena e separando com
lavagem (retira o N no protico), mas, no entanto pode carregar
peptdeos e aminocidos.
3. Fator - nem toda protena tem 16% N. Diferentes protenas
necessitam de diferentes fatores de correo pois tem diferentes
seqncias de aminocidos
5. Desvantagem: utiliza substncias corrosivas/muito oxidantes

KJELDAHL
considerado um mtodo padro para determinao de
protenas, largamente usado.
Alta preciso e boa reprodutibilidade, o principal mtodo para
determinao de protenas em alimentos.
Como no mede protenas diretamente necessita de um fator de
converso (F) para converter a medida de N para protenas.

Um fator de 6.25 (equivalente a 0,16 g N / g de protena) usado

para muitas aplicaes, existem outros fatores de converso.
Cada protena tem um fator de converso que depende da
composio de aminocidos.

DESTILAO DIRETA
Modificao do mtodo de kjeldahl.
Sem digesto.

Amostra + NaOH/Na2SO4

NH3

Mistura-se com H3BO3 e titula-se com cido.

Necessita de curva de calibrao.

usado como rotina em alguns alimentos,
produtos crus (no qual o tempo mais
importante que a exatido).

Mtodo Dumas (1831)

Determina N total.
Princpio: Combusto a 700-900C produz CO2, H2O e N2.
Combusto da amostra
(700-800C)

Medio
volumtrica
do N gasoso

Separao de N2 em colunas o CO2 e H2O so adsorvidos em uma

coluna especial.
O N2 analisado volumetricamente ou por tcnica instrumental
o N2 medido quando passa atravs de uma coluna que tem um
detector de condutividade trmica no final.
O instrumento calibrado pela analise de um material padro que tem
concentrao de N conhecida, como EDTA (= 9.59%N). Assim o sinal do
detector de condutividade trmica pode ser convertido em contedo de N.

Mtodo Dumas
Assim como o Kjeldahl necessrio converter o teor de N na
amostra para teor de protenas, usando o Fator de converso.
Problemas: medida difcil e sujeita erros pequena qtde de
amostra amostra pode ser no representativa; alto custo inicial.
Equipamento - melhora preciso.
mais rpido que o Kjeldahl (uns 4-10 minutos por medida,
comparado com 2-6 horas para Kjeldahl).
No necessita de reagentes ou catalisador.
fcil de usar.

Titulao com Formol

Formol em alimentos proteicos previamente neutralizados.
Os grupos -NH2 -N=CH2 .
propriedades bsicas e acidez.
Titula-se a acidez com NaOH.
% protena = T x 0,17 , onde T= mL de NaOH M para
1000 mL de leite.
Rpido e simples.
Pode subestimar o contedo de leite.

Turbimtrico
Fundamento: medida baseada na turbidez causada pela
protena precipitada por agentes precipitantes (ex.:
c.tricloroactico,
ferricianeto
de
potssio,
cido
Sulfosaliclico).
Precipitante + protena turbidez.

Mede-se o grau de turbidez.

Rpido, simples (protenas lquidas).
Desvantagens: no usado p/slidos; depende da protena;
depende de padres; precipitao de interferentes.

Mtodos Espectrofotomtricos
As curvas de calibrao de absorbncia (ou turbidez) versus
concentrao protenas preparada usando uma srie de
solues de concentrao conhecida.
A concentrao de protenas determinada a partir da curva de
calibrao.
As principais diferentes entre os testes so os grupos qumicos
responsveis pela absoro da radiao, exemplo: ligaes
peptdicas, grupos aromticos, grupos bsicos protenas
agregadas.

Mtodos espectrofotomtricos UV e visvel

Desvantagens: necessrio que as protenas estejam diludas
em solues transparentes, e que no contenham substncias
que absorvam no mesmo comprimento de onda que as
protenas.
Preparao de alimentos exige: homogeneizao, extrao por
solventes, centrifugao, filtrao, que podem consumir muito
tempo e trabalho.

Para alimentos em que protenas se tornam agregadas ou

ligadas covalentemente com outras substancias, a separao
mais difcil.

Absorbncia depende do tipo de protena.

Teste do Biureto (Riegler, 1914)

Princpio - Sais de Cu+2 em solues alcalinas produzem cor
violeta ou roxa quando interagem com ligaes peptdicas.

Medida feita em um Colormetro ou espectrofotmetro.

Faz-se a reao e aps uns 15-20 minutos l-se a absorbncia a
540 nm.
Determina protenas.
Cor formada depende de cada protena.

A intensidade da cor proporcional quantidade de protena

Usado em determinaes bioqumicas (albuminas como rotina).

Vantagens:
Especfico
Simples, rpido e barato
Desvantagens:
Necessidade de uma curva de calibrao tomada com um
padro conhecido de protena.

B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)

Reao das protenas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e
reagente de Biureto (Cu+2 em condies alcalinas).

Reao: Oxidao de aminocidos aromticos - tirosina e

triptofano - com aparecimento de uma colorao azul.
Colorao azul colormetro (500 a 750 nm) curva padro.

Mais sensvel que o teste do Biureto e que determinao por UV.

Mais especfico - poucos interferentes.
Desvantagens:
lento: operaes mltiplas e perodo de incubao
Necessita de uma curva padro com protena conhecida

Intensidade da cor depende de cada protena.

C. Mtodos Espectofotomtricos UV
Princpio - protenas possuem absoro UV em 280 nm
(aminocidos aromticos)
Aa: tirosina, triptofano, fenilalanina.

Rotina em leites.
Grande variedade de aplicaes.
Custo elevado e calibrao.
Rpido, simples, no usa reagentes e no destrutivo.
Pouco preciso - depende da composio dos aminocidos.

cidos nuclicos podem interferir.

Mtodo Dye-binding
Corantes que reagem quantitativamente com protenas.
Lisina, histidina e arginina reagem com -SO3H.

Corante + protena complexo insolvel.

Mede-se o excesso de corante colorimetricamente.
Equipamento faz em conjunto a reao colorimtrica, a
filtrao do complexo insolvel e a medida colorimtrica.

A quantidade de protena presente na soluo original

proporcional quantidade de corante que reagiu (ligou):
Corante ligado = corante inicial corante livre.

Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto bfalo e preto

amino 10B.
Boa correlao com o Kjeldahl.
Rpido, simples, exato, econmico.

DYE-BINDING

Fundamento:
Amostra
+
corante
(exc.)

Formao
de um
complexo
insolvel

Separao
(centrifugao
ou filtrao)

Mede o
excesso de
corante
que no
reagiu

Por diferena obtmse a quantidade de

protena

Desvantagens:
Aquisio do equipamento

Separao de protenas

Solubilidade
Cromatografia:
- tamanho,
- carga,
- adsoro.

Anlise de aminocidos
Determinar a composio de aminocidos nas protenas.
A protena hidrolisada usando um cido forte ou
enzimas libera aminocidos.

Cromatografias separam os aminocidos troca

inica, afinidade ou por absoro.