La Green Fluorescent Protein (GFP), une protine

incontournable pour limagerie du vivant

Exemples dapplications ltude du dveloppement vgtal

Franois Roudier
Equipe Diffrenciation et Identit Cellulaire

Biologie Cellulaire

Aequorea victoria : linventeur de la GFP

La GFP : une protine fluorescente par transfert dnergie

La GFP : une structure en lanterne et un

fluorophore protique auto-catalytique

- 238 aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles

- Forte stabilit : rsiste 65C, pH entre 5,5-12,2, 8M ure, 1% SDS, protases (2j)

De la GFP sauvage la GFP amliore

Plusieurs mutations ont t introduites pour :

- Optimiser lexpression de la protine
Usage optimal des codons et limination dun intron cryptique (20X plus de protine)
Maturation du fluorophore (4X plus vite)

- Modifier les proprits spectrales de la protine

Pic dexcitation unique 490 nm
Brillance (X6)

Un outil versatile pour ltude du vivant

La GFP : une protine non toxique pour des

mthodes de visualisation non invasives

Variants de la GFP et autres protines fluorescentes

CFP GFP

YFP

(DsRED) RFP

Discosoma striata

Des protines fluorescentes avec diffrentes proprits spectrales

Une plante modle: Arabidopsis thaliana

Le dveloppement vgtal est essentiellement post-embryonnaire

et rsulte de lactivit constante des mristmes
Animal

Plante

Zygote

Embryon

Adulte

Organogense et
Croissance indtermine

Les mristmes contiennent les cellules souches et sont

organiss en domaines fonctionnels
Mristme apical

feuille

mris t me
primordium
ZC

ZP

MM

ZP

L3 L2

L1

Arabidopsis
adulte

Mristme racinaire

Exemples dapplication de la technologie GFP ltude

du dveloppement des plantes

- Profil dexpression dun gne

- Etude fonctionnelle dune protine

Localisation subcellulaire

pPromoteur:GFP
(fusion transcriptionnelle)

pPromoteur:CDS::GFP
(fusion traductionnelle)

Mouvement
Interaction protine-protine (FRET)

- Biosenseurs

Le mristme racinaire : une organisation dpendante de

divisions strotypes des cellules souches

stele
epidermis

endodermis
cortex

Division asymtrique
lateral
root cap
quiescent
center
(QC)
columella

cortex/
endodermis
initial

Cell types in the Arabidopsis root meristem

Deux mutants dficients dans la mise en place et la

diffrenciation de lendoderme
cor
end

Wild type

cor+end

scarecrow
(scr)

short-root
(shr)

cor

Expression de SCR dans la racine

cortex

Promoteur SCR
GFP gene

endodermis

ARN GFP
c/e initiale
QC

Protine GFP
pSCR

GFP

Localisation de la protine de fusion SCR::GFP

cortex

Promoteur SCR
SCR gene

GFP

endodermis
c/e initiale

ARN

QC

SCR::GFP
pSCR

SCR GFP

(Complmentation du mutant scr)

SCR est ncessaire pour la mise et place et la

diffrenciation de lendoderme dans la racine
cortex
cortex

endodermis

endodermis

c/e initiale
c/e initiale

QC
QC

pSCR

GFP

pSCR

SCR GFP

SHR contrle la mise et place et la diffrenciation de

lendoderme dans la racine de faon non cellule-autonome

ep

ep co

st

co

st
en

en
in

pSHR

qc

GFP

in

pSHR

qc

SHR GFP

La protine SHR bouge de la stle vers lendoderme !

Analyse du transcriptome de lendoderme racinaire

Digestion
paroi

pSCR:GFP

Rcolte pointe
racinaire (15000)

Plantules in vitro

Hybridation

Puce Affymetrix ATH1

25K gene arrays

Triage par fluorescence

des protoplastes GFP+

Extraction ARN
Amplification
Marquage des sondes

300 000 protoplastes

Endodermis

Epidermis

Lateral
rootcap

Pericycle

Collection de
marqueurs spcifique
dun type cellulaire
Endo
+
Cortex

QC

Le mristme apical caulinaire

Le mristme apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle

pour la croissance, lorganogense et auto-maintien

Auto maintien
Organes
latraux
ZC
ZM

ZM

ZM

Feuille
Jeune feuille

Tige

Primordium

Le mristme apical caulinaire

Une organogense dynamique et structure

Vue davion

Cintique sur 65h

Acquisition toutes
les 2h30

QuickTime et un
dcompresseur TIFF
sont requis pour visionner cette imag e.

Marqueurs molculaires des zones fonctionnelles et identits

cellulaires du MAC

SHOOT MERISTEMLESS

WUSCHEL

LEAFY
AINTEGUMENTA

CLAVATA1

CLAVATA3

ATML1

CUP-SHAPED COTYLEDONS

pANT:GFP, un marqueur de linitiation et de la mise en

place des primordia foliaires

pANT:GFP

Coloration vitale + pANT::GFP

Dynamique de la diffrenciation des primordia : recrutement puis prolifration

pANT:GFP

T = 0h

T = 32h

T = 24h

T = 48h

Dynamique de la diffrenciation des primordia : recrutement puis prolifration

aprs le recrutement : prolifration cellulaire

Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D

Une disposition en spirale prdictible

P0
P5

P3

P6
P2
P1

P7

P4

Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs

Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs

Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs

Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs

Lauxine, une phytohormone transporte de faon polarise, est

implique dans le contrle de la phyllotaxie

Transport polaris de lauxine (AIA):

Localisation des transporteurs laide de FPs
1

(membrane apicale)

Sens du TPA

AIAH
AUX
H++ AIA-

pAUX1:AUX1::YFP

PIN

Transporteur defflux
(membrane basale)

AIAH
3

Transporteur dinflux

pPIN1:PIN1::GFP

Modle du contrle de la phyllotaxie par PIN1 et des

flux dauxine (DR5:GFP)
pDR5:GFP
Un senseur transcriptionnel de lauxine
(pDR5 : 9 x AuxREs)

Auxine

P0

P2

Gradients locaux dauxine par pompage

P3

P1

Interaction entre deux protines

Mesure de linteraction entre deux protines par

"Fluorescence Resonance Energy Transfert (FRET)

D
GFP

D A

A
RFP

1- Compatibilit spectrale des fluorochromes

2- Proximit molculaire des fluorochromes

Co-localisation de deux protines

Application de la technology FRET au vivant :

la protine camlon, un biosenseur du calcium

Mesure ratiomtrique de flux calciques chez le ver, C. elegans

Mesure ratiomtrique de flux calciques chez le ver, C.

elegans
[Ca2+] nulle

Excitation 440 nm

CFP spare de YFP

(pas de FRET)
[Ca2+] faible
YFP/CFP faible
(peu de FRET)
QuickTime et un
dcompresseur Video
sont requis pour visionner cette imag e.

[Ca2+] forte
YFP/CFP lev
(FRET max)

Exemples dapplication de la technologie GFP

Quelques limites
- Profil dexpression de gnes
- Etude fonctionnelle de protines
- Biosenseurs

Localisation subcellulaire
Mouvement
Interaction protine-protine
(FRET)

Limites :
- Sensibilit (difficile de dtecter les gnes faiblement exprims)
- Ajout dune protine (encombrement, environnement bio)
- Panoplie de FPs encore limite

LHP1::GFP

QuickTime et u n
dcompresseur Video
sont requis pour visionner cette image .

Principe de transformation gntique stable chez les plantes

Dbut de floraison
Transformation de la ligne germinale

Slection des transformants

partir des graines

Etapes de
dveloppement

In situ digitale des diffrents types cellulaires de la racine

Assises
cellulaires