CLONACIN DEL ADN

I. DEFINICIN

La clonacin de un gen o un fragmento de

ADN implica la separacin del resto del
genoma, la unin a una molcula portadora
y la insercin en un organismo para poder
amplificarlo muchas veces. Con este
procedimiento se pueden obtener miles e
incluso millones de copias del gen o
fragmento de ADN inicial.

II. APLICACIONES
Un sistema comn es utilizar bacterias
(generalmente, Escherichia coli) y sus
plsmidos. Para clonar genes u otros
fragmentos de ADN en el laboratorio,
primero se asla un plsmido de una
clula bacteriana y luego se introduce el
ADN extrao. El plsmido resultante se
convierte en una molcula de ADN
recombinante, que contiene ADN
procedente de dos fuentes distintas. Se
vuelve a introducir el plsmido en la
clula bacteriana para obtener una
bacteria
recombinante,
que
se
reproduce formando un clon de clulas
idnticas. Debido a que las bacterias en
procesos de divisin replican el
plsmido recombinante y lo transfieren
a sus descendientes, el gen extrao es
clonado al mismo tiempo; es decir, el
clon de clulas contiene muchas copias
del gen.

III.UTILIZACION DE LAS ENZIMAS

DE RESTRICCION PARA PRODUCIR
ADN RECOMBINANTE

La clonacin de genes y la ingeniera gentica fueron posibles gracias

al descubrimiento de enzimas que cortan molculas de ADN en una
cantidad limitada de ubicaciones especficas.

Estas enzimas denominadas endonucleasas de restriccin o enzimas de

restriccin, se descubrieron a finales de la dcada de 1960 cuando los
investigadores estudiaban las bacterias. En el estado natural, estas enzimas
protegen a la clula bacteriana contra la entrada de ADN de otros
microorganismos, como, por ejemplo, lagos u otras especies de bacterias.

IV. CLONACION DE UN GEN

EUCARIONTE EN UN
PLASMIDO BACTERIANO

El plsmido original se denomina En primer lugar, pueden aislarse con

vector de clonacin, que se define facilidad de las bacterias y manipularse
como una molcula de ADN que para formar plsmidos recombinantes
puede transportar ADN extrao a una mediante la insercin de ADN extrao in
clula y replicarse dentro de ella. Los
plsmidos bacterianos se emplean
en forma universal como vectores de
clonacin debido a dos razones.

vitro, y luego volver a introducirse en las

clulas bacterianas. En segundo lugar,
las clulas bacterianas se reproducen
con rapidez y en el proceso multiplican
todo el ADN extrao que albergan.

PRODUCCION DE
CLONES EN CELULAS

Se comienza con el
aislamiento del plsmido
bacteriano de las clulas
de E. coli y del ADN que
contiene
el
gen
en
cuestin
de
clulas
humanas cultivadas en el
laboratorio. El plsmido ha
sido sometido a ingeniera
gentica para portar dos
genes que ms adelante
sern tiles.

La misma enzima de
restriccin digiere tanto el
plsmido como el ADN
humano
y
produce
extremos cohesivos. La
enzima corta el ADN del
plsmido en el nico sitio
de restriccin dentro del
gen lacZ, pero tambin
corta el ADN humano en
mltiples sitios, generando
varios
miles
de
fragmentos.

Luego se mezclan los

fragmentos de ADN humano
con plsmidos cortados para
permitir la formacin de
pares de bases entre los
extremos
cohesivos
complementarios.

El ADN preparado en el
paso 3 se mezcla con
bacterias portadoras de
una mutacin en su propio
gen
lacZ,
que
las
incapacita para hidrolizar la
lactosa. Bajo condiciones
experimentales
adecuadas, las clulas
adquieren el ADN extrao
por transformacin.

En este caso la clonacin,

las bacterias se siembran
en un medio solido de
nutrientes
(agar)
que
contiene ampicilina y x-gal,
que es una molcula
similar a la lactosa.

SECUENCIACION DEL ADN

Si se dispone de un preparado puro de muchas copias de un fragmento de
ADN de hasta 800 pares de bases de longitud, se puede determinar la
secuencia del fragmento en una mquina de secuenciacin. El cientfico
britnico Frederick sanger desarrollo la tcnica de secuenciacin sistemtica
que se describe en la figura; es la que se denomina con frecuencia mtodo de
terminacin de la cadena por didesoxirribonucleotidos. Incluso con la
automatizacin la secuenciacin, los 2900 millones de pares de bases de un
conjunto haploide de cromosomas humanos representan un desafo
formidable.