EVALUACIN DE LAS BACTERIAS ANTAGONISTAS

PARA CONTROL BIOLOGICO DE PODREDUMBRE DE

CABEZA DE BROCOLI CAUSADA POR PSEUDOMONAS
FLUORECENS.

AUTORES Xiaohui Cui y Rob Harling

Scottish Agricultural College, West Mains Road, Edimburgo EH9 3JG, Escocia, Reino
Unido.
Aceptado para su publicacin el 15 de diciembre 2005.

Solandy contreras 1610699

Julissa gutierrez1610151

INTRODUCCION
La pudricin de cabeza de brcoli en pases como

Australia, Estados Unidos, Irlanda y reino unido han

enfrentado la problemtica en la cual participa
Pseudomonas fluorecens como un agente aislado de la
pudricin de brcoli. La cual reduce su produccin hasta
en un 50%.
Teniendo en cuenta que Pseudomonas fluorecens es un
tipo de bacteria con amplia gama de agentes
antimicrobianos incluidos en el control de diversas
enfermedades.

Objetivos
Identificar y analizar la sustancia antibitica producida por

Pseudomonas fluorecens m6418.

Determinar si Bacillus sp A 24 es capaz de degradar el

QSS acihidroxyoctanoyl homoserina lactona producido

por el patgeno Pseudomonas fluorecens 5064.
Evaluar Pseudomonas fluorecens y m6418, Bacillus sp

A24, por sus habilidades para antagonizar el patgeno P

fluorecens 5064 y el control de la pudricin de cabeza de
brcoli.

Materiales y mtodos
Primero se seleccionaron las cepas a trabajar en el ensayo.

La protagonista Pseudomonas fluorecens 5064 asilada de una planta enferma

(colegio agricultural escocs) al sureste de escocia.
Incubacion 26c
Agar Luria-bertani
M6418 mutante derivada P fluorecens.
Incubacion 26c
Agar Luria-bertani+kanamicina(50mg/L)
Ensayo antifungico (PDA) 28C
Bacillus sp A24 incubo a 30C

10 ENSAYOS DE GRAN INTERES:

Extraccin de antibiticos.

Cromatografa en capa fina.

Ensayo anti fngico.
Ensayo de degradacin QSS.

Diclorometano.
Cuantificacin del numero de bacterias viables.
Efectos de m6418 cepa mutante de P. fluorescens 5064 y

su crecimiento en cultivo in vitro.

Dinmica poblacional de m6418 y P. fluorescens 5064 en
coinoculacin sobre plntulas de brcoli.
Extirpado prueba de patogenicidad cabeza brcoli.
410 FITOPATOLOGA.

 Extraccion de antibiotico

Cepa control(-)P fluorecens

extraccin hecha 2 veces v 1:1

de diclorometano.
se disolvi en 1ml de metanol a

Cromatografa de capa fina

Placas cloroformo/acetona
V:v: 9:1

desde 1ml LB se prepar m6418 a

26C *50-55hr = D.O 2,1-500nm

diclorometano en sus fases orgnicas se

Combino
secado evaporacin 37C
PDTO: disuelto 1mlmetanol [] 1000>cultivo
original
esterilizado.

20l c/antibitico visto en placas slice de gel

a 60F254
*UV de onda corta +reactivo pauly
* reactivo de Ehrlich 1% y TLC

placas reveladas: luz UV

bandas en blanco= 40l cloroformo 4C

ENSAYO ANTIFUNGICO

8mm de muestra (PDA)

Sumergido oosporas 106oosporas/ml
Pythium ultimum

Preparacion de sensidisco 1 empapado antibitico m6418 y 2 cloroformo

metodo dual.

Incubacion a 28C /2 dias

DEGRADACION QSS
Coinoculacion Bacillus sp A24
Pseudomonas fluorecens 5064
En 300ml LB 6 hr antes y 6hr despus
48hr
Extracto de QSS disuelve con 50 l etanol 95%
(bioensayo AHL)
Biosensor E. coli (PSB401) RTA a QSS exgeno
CUANTIFICACION DE #DE CELULAS VIABLES
2l muestra
10 diluciones APE
50L de c/dilucion agar LB inc 30C 2dias
esta prueba se llevo a cabo por triplicado

Efectos de m6418 cepa mutante de P. fluorescens 5064 el

crecimiento en cultivo:
Siembra 1 semilla en 5 macetas
(25 semillas de 10-18cm)X
4semanas

Seleccin de hojas verdaderas

(25)+pulverizacin de hojas y
aplicacin del tratamiento X
macetas

[] bacteriana 1X108UFC/ml P f
5064RIFR,m6418,
5064, pulverizacin al mismo
tiempo

Incubacin: fotoperiodo 16hr con

alta humedad 100% a
20%X10C (noche)

Tambin estas cepas se

sembraron en plantas control

Eliminacin de hojas
en (1,2,3,4,8y al
da 16)

Llevadas a tubos con

10ml
de APE
y llevados a
ultrasonidos 40KHz X
7min
Las diluciones en serie
de la suspensin
bacteriana se llevaron
a alcuotas de 100L y
se llevaron a placas
(LB)

P fluorecens 5064 en LB
+RIFAMPICINA
P fluorecens m6418 LB+
KANAMICINA
INCUBADAS A 30C /48hr

EXTIRPADO DE PATOGENICIDAD DE LA CABEZA DE

BROCOLI
Cabeza de brcoli : maduro (hallados en supermercados)

Mtodo de inoculacin

Distribuidos en 2 piezas de 2X2cm sobre fibra de algodn

Previamente empapadas con suspensin bacteriana.
FITOPATOLOGIA : en esta prueba se realizaron mtodos
de coinoculacin con cada cepa original y modificadas. A
continuacion se describe el procedimiento.

fitopatologa
Las muestras obtenidas luego del fotoperiodo se

coinoculan con las siguientes condiciones.

Coinoculacion

Relacion [ ]

m6418 P f 5064salvaje; Pf
5064 solo mas control de
agua

1:1 concentracion final

1X108UFC/ml

Relaizada 10
veces x
duplicado

Bacillus sp A24 aplicados 6

tratamientos incluyendo las
diferentes relacione entre
Bacillus sp y P f 5064

1:0,1:3,1:1,3:1,0:1 mas
uno agua control
1X108UFC/ml y con una
nueva a 1X106UFC/ml

Realizada 10
veces x
duplicado

RESULTADOS
Identificacin de los antibiticos producidos por la cepa m6418
cepa
La extractos de los antibiticos de m6418 tensin y de tipo salvaje P.
fluorescens 5064 se separaron por TLC en cloroformo / acetona
se
identificaron
tentativamente
el
antibitico producido por m6418 cepa
como Prn. Los resultados de la reaccin
de color eran ms coherente con esta
conclusin. El spot antibitico volvi
naranja con reactivo de Pauly y rojo con
el reactivo de Ehrlich (Fig. 1), indicando la
presencia de compuestos fenlicos y
formas pirrlicos

Se realiz un bioensayo usando Pythium ultimum para identificar

actividad antibitica de la mancha producida por Prn m6418 cepa.
Pythium ultimum es un hongo de crecimiento rpido, y despus de 2
das crecimiento de la colonia se inhibi en el lado de las placas de
agar con que contiene el disco de papel de filtro Prn (Fig. 2).
El perfil de TLC tambin permiti la deteccin de otros antibiticos
como Phl, Plt, y PHZ en m6418 tensin y de tipo
salvaje P. fluorescens 5064 no produjo ningn antibitico detectables
que aparece arriba. Aunque una mancha de color tambin apareci a
Rf 0,48 en el de tipo salvaje P. fluorescens 5064 cromatogramas (Fig.
1).
este punto, bajo la luz ultravioleta de onda corta, tena fluorescencia
azul en lugar de la punto fluorescente oscuro correspondiente a Prn en
el cromatgrafo gram para cepa m6418 ; Por lo tanto, llegamos a la
conclusin que no era Prn.

La degradacin de P. fluorescens 5064 QSS por Bacillus sp. A24.

Biosensor E. coli (pSB 401) produce luminiscencia en respuesta a

la presencia de AHL producida por P. fluorescens 5064, como hemos
mostr en un estudio anterior (11). No era visible luminiscencia
observado cuando cualquiera de Bacillus sp. A24 se inocul en el
medio antes de la cepa 5064 o cuando fueron co inoculado (Fig.
3). El Bacillus sp. As A24 tiene una fuerte capacidad de degradar la
QSS producida por P. fluorescens 5064. Cuando P. fluorescens 5064
se incub 6 h antes de Bacillus, una luminiscencia dbil pero visible
ocurrido (Fig. 3). Esto indic que, aunque inoculado 6 h ms tarde de
P.fluorescens 5064, Bacillus sp. A24 podra todava crecer bien y
destruir la mayor parte, pero no todos, de la QSS producida por P.
fluorescens 5064.

Efectos de Bacillus sp. A24 en el crecimiento

de P. fluorescens 5064
Cuando P. fluorescens 5064 y Bacillus sp. A24 fueron
inoculados simultneamente, la relacin nmero final de
clulas de P. fluorescens a Bacillus, despus de 2 das
de incubacin, era una y veinticinco (nmero de clulas
actul cultivable eran 5,0 10 5:. 1,2 10 7, P.
fluorescens 5064 / Bacillus sp A24 ).
Incluso cuando se inocularon 6 h ms tarde de P. fluorescens 5064,
Bacillus sp. A24 todava podran crecer mucho y mostr una proporcin
de P. fluorescens para Bacillus de 1: 1.2 .De Bacillus Sp. A24 se inocul
6 h antes de P. fluorescens, P. fluorescens entonces no podra ser
detectada en el cultivo (nmero de clulas 0: 8,0 10 8, P. fluorescens /
Bacillus). Basndose en estos resultados, Bacillus sp.A24 a cabo podra
competir P. fluorescens 5064.

Efectos de la m6418 tensin en P. fluorescens 5064 crecimiento

de cultivo.
M6418

inhibi significativamente el crecimiento de P.

fluorescens 5064 en cultivo lquido el mayor efecto inhibidor se
produjo cuando cepa m6418 se inocul 6 h antes de P.
fluorescens 5064 ,el nmero de clulas era cinco veces menor
que cuando se cultivan solas.

en el experimento recproco donde el efecto de P. fluorescens

en 5064 Se examin el crecimiento de cepa m6418 , la

poblacin m6418 inicialmente se mantuvo baja cuando se
inoculan 6 horas ms tarde que los de tipo salvaje 5064, pero
aument rpidamente despus de 20 h con incubacin (Fig. 5).
Por el contrario, la poblacin 5064 se mantuvo en un nivel bajo

a lo largo .el experimento cuando se inocula 6 h ms tarde la

cepa m6418 (Fig. 4).

Eficacia Biocontrol de Bacillus sp. A24 y P. f l uo r e s c e

ns m6418 tensin en pruebas de patogenicidad cabeza
brcoli extirpados

La inoculacin
de cabezas de
brcoli con
patgenos P.
fluorescens
5064 dado
lugar a la
enfermedad el
80% despus
de 5 das con
amplia
pudricin
blanda negro.

La inoculacin
simultnea del
agente patgeno
con el m6418
mutante no
patgeno reduce
la enfermedad a
47% (= 41%
reduccin); tejido
era de color
marrn, pero no
blando podrido.

cabezas que se
inocularo nslo
con agua tena
una puntuacin de
la enfermedad de
20% (cabezas
fueron ligeramente
oscuro y mostr
una prdida de la
floracin cerosa),
que es normal
para los controles
negativos.

Cabezas
inoculados con
la cepa tenan
m6418
prcticamente
ningn sntoma
en absoluto
(3%).

Esto sugiere que

algunos del
oscurecimiento del
tratamiento de
control de agua
puede haber sido
debido a la actividad
bacteriana no
patgena residual
debajo de la
empapado de aguapelusas de algodn
y esta actividad fue
abolido por el
biocontrol actividad
de la mutante

DISCUSIONES
En este estudio, hemos examinado la posibilidad de que el

con- biolgica control de la podredumbre de la cabeza de

brcoli, causada por gpIV P. fluorescens cepas, con dos cepas
bacterianas: un mutante Tn 5 derivadas del patgeno
gen, P. fluorescens m6418, y Bacillus sp. A24.
Hemos demostrado que los dos aislamientos de biocontrol son

inhibidora hacia el patgeno de dos maneras diferentes: cepa

m6418 produce grandes cantidades de la sustancia
antimicrobiana Prn, y Bacillus sp. A24 es capaz de degradar la
homoserinlactona
3-hidroxioctanoil
produjo
por
el
patgeno. P. fluorescens m6418 fue capaz de reducir la
cabeza pudrirse en una cabeza de brcoli bioensayo extirpado
en un 41%; Bacillus sp. A24 fue menos eficaz en el 26%.

Prn ha informado de reprimir una amplia gama de hongos y

patgenos bacterianos, ya sea en bioensayo agar o
patogenicidad
tejido
pruebas,
como
Rhizoctonia
solani
(8),
Botrytis
cinerea
(29,30),
Penicillium
expansum (29), Pyrenophora tritici-repentis (41), Mycobacterium
tuberculosis (14), y Fusarium sambucinum (4).
EI-Banna y Winkelmann (18) probaron el efecto antimicrobiano
de Prn en casi 40 cepas bacterianas y fngicas. En su estudio,
Prn era activo contra varios hongos filamentosos
incluyendo Pythium ultimum, levaduras, y bacterias grampositivas
(incluyendo
algunos
Especies
de Streptomyces, especialmente S. antibioticus). Sin embargo,
casi todas las bacterias gram-negativas ensayadas,
incluyendo E. coli K12 y P. fluorescens ATCC 13525, fueron
resistentes a las dosis ensayadas

En nuestro estudio, Prn producido por m6418 cepa tuvo

una fuerte actividad antibitica contra Pythium ultimium, as
como de tipo salvaje P. fluorescens 5064 y E. coli JM109
La mutacin en APDA o Gaca de P. fluorescens suprime la
produccin de Prn (9,34).
Un factor sigma codificada por Rops es tambin notificado
a ser necesaria para la produccin Prn (41,43). En nuestro
estudio, la sobreexpresin de Prn en el Tn 5 mutante 6418
implica que el gen interrumpido por Tn 5 es un represor
dentro de la biosntesis de Prn o va reglamento

La investigacin llevada a cabo en este estudio ha

proporcionado pruebas de que la cepa productora de antibitico
m6418 podra ser utilizado como un bioconcentracin agente de
control para controlar la enfermedad de la pudricin de la
cabeza de brcoli. M6418 Strain tena efectos inhibitorios
significativos frente a P. fluorescens 5064 en cultivo, en
plntulas de brcoli, y cabezas de brcoli extirpados.
En el cultivo, el efecto inhibidor de m6418 cepa fue mayor
cuando estaba inoculado y permiti establecer antes
de P. fluorescens 5064, Aunque este no era el caso en las hojas
de brcoli, posiblemente puede ser causa de su menor aptitud
en las hojas. en la mayor concentracin de inculo del patgeno
de 1 10 8 CFU / ml. Sin embargo, a una concentracin de
inculo del patgeno 1 10 6 UFC / ml, Bacillus sp.A24 hicieron
podredumbre