UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y

ZOOTECNIA
PRACTICA Nro..
TECNICAS DE IDENTIFICACION DEL
GENERO CLOSTRIDIUM EN
ALIMENTOS

INTRODUCCION

Dentro del Gnero Clostridium existe una variedad de

especies dentro de las cuales estn el Cl. perfringens,
Cl. botulinum, Cl, spticum, Cl. novy, Cl, tetani, etc.
Estas difieren enormemente en cuanto a sus
caractersticas culturales.
Clostridium botulinum.
- Letal por toxina
- Normalmente no se asla ni hace recuento
- Se busca la presencia de la toxina
Clostridium perfringens.
Causante de intoxicaciones alimentarias
Cuando los grmenes estn 10 a la 6 o ms/g
En los 5 serotipos (A-E) solo la A y C estn implicados
en intoxicaciones alimentarias.

Enfermedades producidas por alimentos...

INTOXICACIN: causadas por la ingesta de

TOXINAS producidas por m.o. antes de la
ingesta del alimento.
Ej: S. aureus, B. cereus, C. botulinum
TOXI-INFECCIN: Causadas por m.o. que
elaboran sus toxinas durante el proceso de
proliferacin en el tubo digestivo.
Ej: C. perfringens
INFECCIONES: Causadas cuando se ingieren
alimentos que contienen ciertos m.o. y estos
invaden la mucosa intestinal y se multiplican en
ella.
Ej. Salmonellas y V. parahemolyticus

METODOS DE IDENTIFICACION Y RECUENTO

A. Reacciones hemolticas en medio agar sangre
con sulfato de neomicina.
B. Formacin de colonias negras en medios de
agar sulfito + polimixina o neomicina
recuento).
C. Recuento de Cl. Perfringens, basado en la
tcnica del NMP.
En los 3 procedimientos las colonias deben ser
sometidas a pruebas confirmativas.

CARACTERISTICAS CULTURALES;
El aspecto de las colonias de Cl. perfringens en
agar sufito polimixina son redondas covexas y de
una coloracin negra algunas son mucoides, en
agar yema de huevo son pequeas, globosas,
traslcidas, mucosas y que producen
opalescencia. En agar sangre forman colonias
tambin redondas cremosas, convexas y
producen una doble hemolisis alfa y beta,
caracterstico.

Clostridium botulinum
RESERVORIO: Tierra, sedimentos marinos,
intestino de animales de sangre fra o caliente.

TIPO DE ENFERMEDAD: Intoxicacin.

ALIMENTOS MS FRECUENTEMENTE
INVOLUCRADOS: Comidas caseras enlatadas o
empacadas al vaco, embutidos ahumados o
curados con especias de manufactura casera.
PERIODO DE INCUBACIN: 12 a 36 hrs.

Clostridium botulinum
MORFOLOGIA DEL BACILO
Esporas subterminales con
engrosamiento.
Potentes neurotoxinas
(proteicas y termolbiles):
Clasificadas de la A a la
G.
Causan parlisis flcida
por bloqueo de la
liberacin de acetil
colina en las neuronas.

 Los Clostridium perfringens en un frotis,

demuestran ser bacilos gram-positivos gruesos de
bordes redondeados y de longitud poco variable,
cortas.

Cl. perfringens
RESERVORIO: Suelos, tracto gastrointestinal de
hombre y animales.
TIPO DE ENFERMEDAD: Toxi-infeccin.
ALIMENTOS MS FRECUENTEMENTE
INVOLUCRADOS: Carnes rojas y de aves
cocidas inadecuadamente. Salsas. Alimentos
enlatados.

PERIODO DE INCUBACIN: 8 a 24 horas

MATERIALES.

Estufa de incubacin.
Balanza analtica.
Mechero Bunzen.
Asa de kolle.
Esptula de Drigalsky
Gradilla y canastillas
Matraz de Erlyn Meyer.
Tubos de ensayo.
Probeta graduada de 100 ml.
Placas petri.
Medios de cultivo.
Muestras clnicas.
Batera de coloracin Gram

METODOLOGIA
PRUEBA EXPLORATORIA PARA LA DETECCION DE LA TOXINA
DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Incubar 2-10 g del producto alimenticio que se considere
adecuado para el crecimiento de los esporos (por ejemplo,
pescado y productos derivados, alimentos enlatados,
platos a base de carne cocinados) en un tubo de ensayo a
30C durante 7-10 das.
Homogeneizar la muestra incubada con un peso igual de
solucin salina estril.
Centrifugar el homogeneizado a alta velocidad durante
una hora.
Someter el estrato sobrenadante a las pruebas de
toxicidad por inyeccin intraperitoneal en ratones.
Observar los animales durante 4 das, es positivo cuando
se presenta paralisis motora progresiva, sntomas que
pueden aparecer a las 4 5 horas en forma de abdomen
contrado y disnea.

Tcnica para recuento en placa en anaerobiosis

para Cl. Perfringens.
1. Para alimentos solidos, congelados; triturar el
alimento en un homogenizador adecuado para
la cantidad de muestra (10 g 100g)
2. Realizar diluciones seriadas (1:10 1:1000) si es
necesario.
3. Inocular dos placas por cada dilucin en agar
sangre de caballo + sulfito, polimixina, en una
cantidad de 1 ml con ayuda de la esptula de
Drigalsky

4. Incubar las placas a 35 37 C durante 48 hs.

Una de ellas en anaerobiosis y la otra en
aerobiosis.
5. Para el recuento identificar las colonias de
color negro redondas y convexas, para el
calculo es similar a lo descrito para el REP.

BIO-BAG Y CMARA ANAERBICA

Cl. perfringes

 Haga un frotis de las colonias que crecieron en

el agar sangre
Tina con la tcnica de Gram
Observe con aceite de inmersin el frotis
De acuerdo a lo observado en cada uno de los
frotis realice las pruebas correspondientes.
Para la identificacin definitiva

 PRODUCCION DE INDOL.
Dado que el medio base VL para anaerobios
contiene triptona, se utiliza el rectivo de
Kovac (tiras de papel), el cual se introduce en
los tubos inoculados e incubados. El viraje del
reactivo a un color rosado, indica una reaccin
positiva.

REDUCCION DE NITRATOS ANITRITOS.

Para la ejecucin de esta prueba se utiliza el caldo
nitrato (CN). Luego de la inoculacin de las cpas en
los tubos se incuba a 37oC durante 48 horas,
posteriormente se agrega 2 gotas del reactivo A (*) y
dos gotas del reactivo B (**). La aparicin de un
color rojo indica la presencia de nitritos, si no
aparece el color rojo vinoso se agrega mallas de zinc,
si hubiera nitratos NO3 en el medio este ser
reducido a nitritos y aparecer el color rojo vinoso,
por tanto la bacteria no ha degradado el nitrato. Por
el contrario si no aparece el color rojo vinoso se
debe a la ausencia de nitratos, es decir que la
bacteria ha reducido hasta NH3 y N2.

 * Reactivo A: - Acido
sulfanlico 0.8 g
- Acido actico (5N)
100.00 ml.
** Reactivo B: - Alfa
naftilamina 0.6 g.
- Acido actico (5N)
100.00 ml.

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