AUTOMATIZACIN EN

HEMATOLOGA

PRESENTADO POR: Gabriela lvarez Ovie

 La

evolucin de la instrumentacin en
hematologa se inici a mediados de
1950.
Existen
dos
tipos
de
equipos
automatizados
segn
su
funcionamiento; uno por impedancia y
el otro por dispersin de luz .Todo
equipo automatizado, suministra dos
tipos de resultados: un informe numrico
y un informe grafico (histogramas).

El margen de error
obtenido mediante los
mtodos
manuales
(20%),
disminuye
enormemente con el
desarrollo de estos
equipos (menor al 1%).

COMPONENTES QUE CONSTITUYEN

EL CONTADOR ELECTRNICO.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

DILUIDOR
COMPRESOR ASPIRADOR
DISPOSITIVO DE MEDIDA
TRANSDUCTOR
DISCRIMINADOR
PROCESADOR
REGISTRADOR

DILUIDOR

Disminuye la concentracin de la sangre hasta

el nivel adecuado para el funcionamiento del
contador.
Generalmente diluye poco para el recuento de
leucocitos (por ejemplo, a 1/300 en el contador
ABX MICROSOT) y mucho para el recuento de
hemates (por ejemplo, a 1/20.000 en el
contador ABX MICROSOT).
La dilucin realizada vara dependiendo del
contador electrnico. Como lquido diluyente
utiliza una solucin isotnica con capacidad
conductora.

COMPRESOR- ASPIRADOR.
Aporta

la presin y el vaco
necesarios para transportar la
sangre,
convenientemente
diluida, al dispositivo de medida.

DISPOSITIVO DE MEDIDA
Es

la cmara donde se cuentan

realmente las clulas sanguneas
(cmara de medida o de lectura).
Su diseo depende del mtodo de
recuento utilizado por cada modelo
de contador.
Puede basarse en un sistema de
deteccin celular por medida de la
impedancia o en sistemas pticos

DISPOSITIVO DE MEDIDA
En los contadores electrnicos ms
avanzados, una vlvula de cermica
reparte la muestra hacia distintas
cmaras de medida. Cada cmara de
medida est especialmente diseada
para el recuento de un tipo celular
(glbulos
rojos,
leucocito
s
o
plaquetas) o para la determinacin de
hemoglobina

DISCRIMINADO
TRANSDUCTOR
R
Transforma

las

seales,
procedentes del
dispositivo de
medida, en
impulsos
elctricos. Suele
ser un
fotomultiplicador.

Diferencia

los

impulsos
elctricos
generados por
cada uno de los
tipos de clulas
sanguneas.

PROCESADOR

REGISTRADOR

Recoge

Imprime

los

datos
obtenidos,
los procesa
y los
proyecta
en una
pantalla.

en
papel los
resultados
conseguidos

MTODOS ELECTRNICOS DE
RECUENTO CELULAR
Cada

contador
electrnico, se basa en
su propio fundamento
para
obtener
los
resultados.

RESISTENCIA ELCTRICA O
IMPEDANCIA
Se

basa en la propiedad de las

clulas sanguneas de no conducir la
electricidad.
La sangre total es diluida en una
solucin de conductividad estable,
por lo que las clulas sanguneas
pasan por un orificio de apertura con
un rea prefijada.
Por dentro y fuera del orificio se

RESISTENCIA ELCTRICA O
IMPEDANCIA
Cuando una clula pasa por el
orificio, se genera un aumento de
resistencia elctrica y un cambio de
potencial entre ambos electrodos
que se registra como un impulso.
El nmero de impulsos corresponde
al nmero de clulas; la amplitud
del
impulso
es
directamente
proporcional al tamao de la clula,

SISTEMA DE CONDUCTIVIDAD
ELCTRICA (RESISTENCIA,
IMPEDANCIA ELCTRICA)
El nmero de
seales
elctricas
generadas indica
el numero de
clulas,
y
la
amplitud de la
seal
elctrica
es directamente
proporcional
al
tamao
o
volumen de las

RESISTENCIA ELCTRICA O
IMPEDANCIA
Este

mtodo
limitaciones.

Como

tiene

algunas

los impulsos elctricos que

van a determinar el volumen
celular se generan en el orificio de
apertura del sistema, para cada
poblacin celular que se quiera
estudiar se deben seleccionar las
condiciones
para
que
sean
analizadas sin error.

RESISTENCIA ELCTRICA O
IMPEDANCIA
Las condiciones ms importantes
que deben tenerse en cuenta son:
La

intensidad de corriente entre

ambos electrodos
El
dimetro del orificio de
apertura
La concentracin de la suspensin
analizada

RESISTENCIA ELCTRICA O
IMPEDANCIA

UTILIDAD:
Recuento

de glbulos rojos

(RBC)
Recuento de glbulos blancos
por impedancia
Recuento de plaquetas (PTL)

Canal de eritrocitos

Al usar la corriente directa, los

resultados son ms exactos, si las
clulas pasan por el centro de la
apertura

Sin el enfoque hidrodinmico las clulas

tienen la tendencia a pasar por otros
ngulos, causando pulsos que no son
indicativos del verdadero tamao de las
clulas

Estos pulsos anormales pueden

producir conteos falsos, que pueden o
no pueden ser corregidos por clculos
matemticos

MTODO DE LA DISPERSIN O
DE LA DIFRACCIN DE LA LUZ

MTODO DEL CAMPO

OSCURO
El

dispositivo de medida consiste en un

capilar por el que circula la sangre
diluida y que es atravesado por un haz
de luz halgena.
Cuando no pasan clulas a lo largo del
capilar, el haz de luz incide sobre una
zona no sensible (disco campo
oscuro); pero si una clula pasa a
travs del capilar, dispersa los rayos del
haz luminoso hacia afuera del disco,

MTODO DEL CAMPO

OSCURO
El

nmero de seales luminosas

detectado indica el nmero de
clulas presentes en la sangre, y la
intensidad de la dispersin luminosa
producida por cada una de ellas es
directamente proporcional al tamao
y contenido de las clulas, siendo de
este modo posible la identificacin y
por tanto el recuento.

MTODO DEL CAMPO

OSCURO
El
nmero
de
seales luminosas
indica el nmero
de
clulas
presentes en la
muestra,
y
la
intensidad de las
dispersiones o
desviaciones
de
los
rayos
luminosos
es
directamente

MTODO DEL RAYO LSER

El

dispositivo de medida consta de un

detector situado detrs de un capilar por
el que circula un flujo continuo de sangre
diluida (citmetro de flujo). Un rayo lser
atraviesa el capilar y se dirige hacia el
detector.
Cuando no pasan clulas a lo largo del
capilar, el rayo lser incide sobre el
detector, pero si una clula pasa a travs
del capilar, el rayo lser es interceptado
por ella y deja de incidir sobre el detector.

MTODO DEL RAYO

LSER
El

nmero de interferencias indica el

nmero de clulas presentes en la
sangre, y el grado de interferencia
que produce cada clula a su paso es
directamente
proporcional
a
su
tamao.
En estos contadores, la luz lser
puede ser, por ejemplo, un lser de
helio-nen polarizado verticalmente a
una longitud de onda de 632,8 nm (el

MTODO DEL RAYO LSER

El grado de
interferencia
es
directamente
proporcional al
tamao de la
clula,
y
el
nmero
de
interferencias
indica
el
nmero
de

CITMETRO DE FLUJO
(BD FACSCalibur)

CITOMETRIA DE FLUJO
Es una tcnica de anlisis celular
multiparamtrico cuyo fundamento se
basa en hacer pasar una suspensin de
clulas alineadas (una por una) delante
de un haz de lser focalizado.
El impacto de cada clula con el rayo de
luz produce seales que corresponden a
diferentes parmetros de la clula y que
son recogidos por distintos detectores que
convierten las seales en seales
electrnicas que luego sern digitalizadas

LECTURA
Las

seales producidas por la

interaccin de las clulas con el
haz de luz son de dos tipos:
Seales de dispersin.
Seales de fluorescencia.

SEALES DE DISPERSIN
Resulta

de la interaccin de la luz con

una partcula que produce un cambio
de direccin (no de la longitud de onda)
en todas las direcciones del espacio.
Las caractersticas morfolgicas que
determinan la dispersin de la luz son:
el tamao celular, la membrana, el
ncleo y el material granular del
interior de la clula (complejidad).

PARMETROS CELULARES
MEDIDOS
Forward

Scatter o FSC: Es una

medida proporcional al tamao de la
partcula que produce la dispersin. La
luz dispersada en ngulo cnico
pequeo (0-10) que casi coincide con
la direccin de la luz incidente.

Side

Scatter o SSC: Es proporcional a

la complejidad de la estructura interna
de la partcula. La luz dispersada en

DETECCION DE LUZ DISPERSADA

HACIA DELANTE (FORWARD
SCATTERED LIGHT, FSC)
SSC

FSC

El detector de FSC convierte la luz

dispersada hacia delante en un pulso de
voltaje
proporcional al tamao de la

LUZ DISPERSADA A 90
(Side SCattered light)

Laser

Detector FSC

Detector de 90 SSC

DETECCION DE LUZ DISPERSADA

LATERALMENTE (SIDE SCATTERED
LIGHT, SSC)

El detector de SSC convierte la luz dispersada

lateralmente en un pulso de voltaje proporcional
al
contenido
en
orgnulos
membranosos

COMPONENTES DEL
EQUIPO
SISTEMA FLUDICO
SISTEMA PTICO
SISTEMA ELECTRNICO

SISTEMA FLUDICO
Consta de dos fluidos:
Un

fluido que contiene las clulas de

la muestra en suspensin.

Un

fluido envolvente o vaina (sheath

fluid) que envuelve y da estabilidad
a la suspensin.

PRESIONES DE LOS
LIQUIDOS
Normalmente

el fluido envolvente y la
suspensin no se mezclan porque
circulan a presiones diferentes.
La presin de la muestra es mayor
(va a ms velocidad)
La
velocidad
aumenta
al
incrementarse la presin de la
muestra ya que aumenta el ancho del
chorro de la misma. Un regulador de
presin controla su caudal cambiando

SISTEMA DE FLUJO

CMARA DE FLUJO
Es de cuarzo en los citmetros de anlisis y
est situada en el centro
El lquido envolvente y la muestra entran en
contacto en la cmara donde desembocan.
El fluido envolvente con la suspensin
celular en el centro, es impulsado para salir
a gran velocidad por un orificio estrecho de
la cmara.
La suspensin celular situada en el centro
del flujo es estrechada hasta un dimetro
de unas 10 micras.

ENFOQUE
HIDRODINMICO
Las

clulas cruzan perpendicularmente

el rayo de luz lser alineadas y de una
en una.
La velocidad de las clulas oscila entre
1.000 y 1.000.000 por minuto
En este punto, se enfoca el haz de luz
(enfoque hidrodinmico ) que rebota en
cada clula dispersndose
El fluido envolvente centra las clulas
hasta el punto de deteccin

PERMITE LA MEDIDA SIMULTANEA DE

MLTIPLES CARACTERSTICAS DE UNA NICA
CLULA:
DISPERSIN DE LUZ

Tamao relativo

Complejidad interna

FLUORESCENCIA
Caractersticas
antignicas,
bioqumicas, biofsicas

Forward Scatter

Side Scatter

Fluorocromos

SISTEMA PTICO
El sistema ptico tiene dos partes:
Optica

de excitacin: lser(s) y las

lentes para dirigirlo y enfocarlo.

Optica

de lectura: lentes que recogen

luz emitida despus de la interaccin
con las partculas y un sistema de
espejos y filtros que la dirigen hacia los
detectores correspondientes.

 La

mayora de los citmetros

llevan una fuente emisora lser.

El
La

lser es una luz monocromtica

longitudes de onda utilizadas

en citofluorometra son 488, 568,
630 y 647 nm

LASER EN CITOMETRIA DE
FLUJO
Existen citmetros de flujo que poseen dos
rayos lser.
La mayora de los citmetros de flujo
emplean luz azul (488 nm). Puede haber
otro laser para la luz verde (515 y 535 nm).
Esto debido a que la mayora de los
fluorocromos usados en CF como la
ficoeritrina o el yoduro de propidio, aunque
excitables con luz azul, poseen un mximo
con luz verde.

Los citmetros de flujo tienen cinco

sistemas pticos de medida:
Dos

de dispersin de luz (uno hacia

delante y otro en ngulo recto), y
tres de fluorescencia
La
luz
de
las
emisiones
fluorescentes se recoge a ngulos
de 90 junto con la dispersin de

PARAMETROS
Con la informacin obtenida por la
dispersin de la luz se miden
simultneamente los parmetros:
Intrnsecos, relacionados con las
caractersticas intrnsecas de la
partcula:
Tamao y complejidad
Extrnsecos, relacionados con las
distintas fluorescencias asociadas

FILTROS OPTICOS
DE INTERFERENCIA, reflejan las longitudes de
onda no deseadas.
Filtros dicroicos

DE ABSORCION, absorben las longitudes de onda

no deseadas. Hay tres tipos:
Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de
longitudes de onda (620 640 nm)
Filtros Short Pass (SWP) : Dejan pasar por debajo
de una longitud de onda determinada (< 575 nm)
reflejando la luz de longitudes de onda mayor.
Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una
longitud de onda determinada (> 520 nm)

TIPOS DE DETECTORES
Se utilizan tres tipos: fotodiodos, fotomultiplicadores
y detectores monocromticos.
Los fotodiodos son detectores de estado slido
empleados para recoger seales de luz de
intensidad grande, como la luz del FSC. Transforman
la seal luminosa en un pulso. La intensidad es
proporcional al nmero de fotones que llegan.
Los fotomultiplicadores constan de un tubo en cuyo
interior
hay varias placas recubiertas por
compuestos muy excitables por la luz que
multiplican la seal. El nmero de Veces que se
multiplica la seal depende del voltaje entre la
primera y la ltima placa.

SISTEMA
ELECTRNICO

Laser

Voltaje
Voltaje

Laser

Las seales luminosas

(pticas)
Tiempo

Laser

Voltaje

Tiempo

son

convertidas
seales

electrnicas

proporcionales,
Tiempo

en
en

forma de pulsos de
voltaje

SEALES ELECTRNICAS
La

interaccin de la clula con el

lser produce una dispersin de la
luz
Las seales de luz (fotones)
golpean un lado del PMT o
fotodiodo y se convierten en un
nmero
proporcional
de
electrones
Los
fotomultiplicadores

UMBRAL
El

instrumento se ajusta para omitir

seales de desechos o ruido
electrnico
Para ello se establece un umbral
que permite procesar y enviar a la
computadora solo las seales con
igual o mayor intensidad
El nivel del umbral se fija con uno o
dos parmetros. Es habitual utilizar

FORMACIN DEL PULSO

A medida que la clula pasa a travs del rayo
lser, la seal ptica va a generar un pulso, que
tiene una altura (o pico), ancho y rea. Cada
pulso se inicia una vez que la clula se asoma
delante del rayo de luz. Despus, si la velocidad
es constante y la clula uniforme, el pulso
desciende simtricamente hasta que desaparece
la seal de esa clula.
Cuando la partcula se encuentra en el centro del
rayo lser se logra la mxima dispersin o
fluorescencia, es el punto ms alto del pulso.
El pulso vuelve a la lnea de base cuando la
partcula abandona el rayo lser.

FORMACIN DEL PULSO

CARACTERITICAS DEL
PULSO
El

rea, altura y
ancho de los pulsos
elctricos
son
proporcionales a la
cantidad total de
luz, la intensidad
mxima y a la
duracin
de
la
seal
luminosa,

FLUORESCENCIA

FLUORESCENCIA
Cuando

un compuesto absorbe la
luz (y por tanto energa) los
electrones ascienden de su estado
basal a un estado excitado.
Los electrones vuelven al estado
fundamental por una serie de
transiciones que implican la emisin
de un cuanto de luz (transicin
radiactiva).

FLUORESCENCIA
La

transicin de absorcin consume

ms energa que la que se
desprende en la emisin, por tanto
la luz emitida es de menor energa
y de mayor longitud de onda que la
luz excitante.
El retorno de la molcula a un
estado de energa ms bajo se
acompaa de emisin de luz
(fluorescencia) y de prdida de

SEALES DE
FLUORESCENCIA
Los

citmetros de flujo detectan

seales
de
fluorescencia
procedentes
de
complejos
Antgeno/Anticuerpo
marcados
con un fluorocromo.
La seal de fluorescencia emitida
es proporcional a la cantidad de
componentes fluorescentes de la
partcula.

FLUOROCROMO

Un

fluorocromo es una molcula que

absorbe luz a una determinada
longitud de onda y la emite a una
longitud superior (menor energa)

TIPOS DE
FLUOROCROMOS
Se usan dos clases de fluorocromos:
Fluorocromos de unin covalente
Fluorocromos
de
unin
no
covalente
La eleccin de fluorocromo depender
de la aplicacin y las longitudes de
onda de excitacin disponibles.

FLUOROCROMOS DE UNION
COVALENTE
Las

molculas orgnicas pequeas

(FITC, biotina) forman una unin
covalente con grupos amino libres en
anticuerpos.
Hay
varios de este tipo, como:
isoticianato
de
fluoresceina,
phicoeritrina, rodamina, rojo texas,
cianinas.
El ms utilizado para marcar protenas
es isotiocianato de fluorescena, el

FLUOROCROMOS DE UNION
NO COVALENTE
Se

unen no covalntemente a
estructuras dentro de la
clula.
Son por ejemplo: Hoechst,
DAPI, Naranja de acrimina,
yoduro de propidio y otros.

PRINCIPALES FLUOROCROMOS
USADOS EN CF

DETECTORES DE
FLUORESCENCIA

Freq

Detector

Fluorescencia

Detector de fluorescencia

Fluorescen
cia

FL-2

FL-1

FSC

La CMF presenta mltiples ventajas frente al

microscopio de fluorescencia y las tcnicas
citoqumicas, como:
Posibilidad

de empleo de mltiples marcajes

frente a un solo marcaje de la citoqumica y la
microscopia de fluorescencia.
Posibilidad de analizar un elevado nmero de
partculas en un corto perodo de tiempo (5000
partculas/segundo).
Posibilidad de cuantificar la intensidad antignica
por medio de los canales medios de
fluorescencia.

HISTOGRAMAS

TAMAO CELULAS
SANGUINEAS
Linfocitos: 50 100
fL
Monocitos: 100 150
fL
Granulocitos:150
380 fL
Eritrocitos: 60 110
fL
Plaquetas: 2 20 fL

HISTOGRAMA GLOBULOS ROJOS

RBC
RBC (( 3.80
3.80 5.80
5.80 ))
HGB
HGB (( 11.0
11.0 16.5 )

HCT
HCT (( 35.0
35.0 50.0
50.0 ))

MCV
MCV ( 80
80 97
97 ))

MCH
MCH (( 26.5 33.5
33.5 ))

MCHC
MCHC (( 31.5
31.5 35.0 )

RDW
RDW ( 10.0 15.0 )

HISTOGRAMA GLOBULOS
ROJOS
ADE: Ancho Distribucin

Eritrocitaria
Heterognea: A.
Adquirida
Homognea: A. Gentica

VCM: Tamao
Macroctico
Normoctico
Microctico

HCM, CHCM: Cantidad

Normocrmica
Hipocrmica

RBC, HTO, Hb:

Poliglobulia
Normalidad
Anemia

SUBPOBLACIONES WBC
LINFOCITOS:
Variantes de
Linfocitos y
Linfocitos maduros
CEL GRANDES
MONONUCLEARES:
Monocitos, Lnea
Mieloide,
Promonocitos,
Prolinfocitos
GRANULOCITOS:
Todos los PMN ms

LINFOCITOS
LINFOCITOS
GRANULOCITOS
GRANULOCITOS

CELULAS
CELULAS
MONONUCLEARES
MONONUCLEARES
GRANDES
GRANDES

RETICULOCITOS

PARMETROS
WBC,

RBC,
MCHC, PLT

Hgb,

Hct,

MCV,

MCH,

RDW-CV, RDW-SD, HDW

Neut%, Lymph%, Mono%, Eo%, Baso

%, NRBC%
MPV
Retic%, Retic#, IRF
IG%, IG#
HPC#

SYSMEX KX-21
El

KX21N es un equipo de sobremesa fcil de adaptar

a cualquier laboratorio.
La vlvula muestreadora SRV permite el control ms
preciso de los volmenes de aspiracin de muestra de
sangre total. El reactivo Stromatolyser WH permite la
determinacin de leucocitos y hemoglobina en dos
cmaras independientes. El KX21N slo necesita 2
reactivos para determinar 18 parmetros
hematolgicos.El KX21N almacena en memoria 300
resultados de paciente. El programa de control de
calidad registra la media acumulada de pacientes
(media de Bull) y grficas de Levey-Jennings en 6
archivos.