HEMATOLOGIA

2014

CLASE TEORICO-PRACTICA
PRUEBAS PARA EVALUAR EL
MECANISMO HEMOSTTICO
Mariana Raviola

HEMOSTASIA

Comprende el proceso que previene

el sangrado cuando un vaso
sanguneo es daado y al mismo
tiempo mantiene la sangre en estado
fluido dentro del rbol vascular

HEMOSTASIA
FASES:
-Respuesta vascular: Vasoconstriccin
localizada a nivel del rea afectada
-Hemostasia Primaria: Formacin de un
agregado o trombo de plaquetas sobre la
superficie de vascular lesionada.
-Coagulacin: Formacin de fibrina que
refuerza el trombo plaquetario.
-Fibrinolisis: Eliminacin de los depsitos de
fibrina.

INDICACIONES PARA EL PACIENTE

Concurrir al laboratorio con ayuno de 8 horas

tratando de realizar el menor esfuerzo fsico posible

FICHA DE ANTECEDENTES DEL

PACIENTE
- Motivo de consulta
-Trombosis actual o anterior
-Gingivorragia, epistaxis, melena, hematuria, hemartrosis
-Sangrado post extraccion dentaria
-Hemorragia post parto o post cirugia
-Menstruacion abundante
-Petequias
-Antecedentes familiares de trombosis o sangrado.
-Consumo de medicamentos: aspirinas, dicumarinicos,
heparina, etc

HEMOSTASIA PRIMARIA
RECUENTO DE PLAQUETAS
- Anticoagulante: EDTA
- Material adecuado: tubos de polipropileno,
vidrio siliconado
- Toma de muestra adecuada: evitar ruptura de
tejido

HEMOSTASIA PRIMARIA
RECUENTO DE PLAQUETAS
Mtodos manuales
- sangre venosa anticoagulada con EDTA
Dil. 1/20 con oxalato de amonio 1% (vn: 150400x103/mm3)
Contadores hematolgicos.

HEMOSTASIA PRIMARIA
RECUENTO DE PLAQUETAS

Es conveniente observar un frotis de

sangre perifrica donde
se controlar el nmero, forma y tamao
plaquetario.

HEMOSTASIA PRIMARIA
Tiempo de sangra
Prueba global de la hemostasia primaria. Evala
interaccin: Plaquetas-Pared vascular in vivo
Depende de:
cantidad y calidad funcional de las plaquetas
cantidad y calidad funcional de vWF
calidad del colgeno.
Duke
VN < 3 min
Ivy
VN < 4.5 min
Simplate VN < 9.5 min
Cohibir cuando tpo > 2 VN

Tiempo de sangra

TS:
sensibilidad -
especificidad -
reproducibilidad
Afectado por: fro, ejercicio,
ansiedad, presin del corte,
direccin de la incisin,
barrido excesivo

HEMOSTASIA PRIMARIA
Retraccin del Coagulo

Se produce a travs de la interaccin de la GPIIbIIIa con la actina del citoesqueleto, requiere ATP
como fuente de energa, depende de varios
factores, calidad y cantidad de plaquetas, cc de
fibringeno, hematocrito, es poco sensible, y muy
influenciada por la limpieza del material

RETRACCION DEL COAGULO

HEMOSTASIA PRIMARIA
Retraccin del Coagulo
Se coloca 1 ml de sangre en tubo de hemolisis de
vidrio bien limpio, se mantiene a 37C,a la hora
se observa la magnitud de la retraccin.
El resultado se expresa en cruces. Cuando el
coagulo se ha despegado por completo de la pared
del tubo se considera retraccin total(+++),
cuando no hay retraccin es aretrctil, y cuando
queda un cuello de fibrina y un sedimento de
hemates se llama fibrinocruorico.

HEMOSTASIA PRIMARIA
Prueba del Lazo
Evala fragilidad capilar aplicando una presin
positiva que aumenta la presin sangunea por
obstruccin del recorrido venoso.
Depende de calidad y cantidad de plaquetas,
calidad del vaso y los tejidos adyacentes y del
gradiente de presin que tiende a generar la
extravasacin

HEMOSTASIA PRIMARIA
Prueba del Lazo
Se coloca el esfigmomanmetro en el antebrazo y
se deja 5 min. a una presin media entre la
mxima y la mnima, se quita la presin y se
observa la aparicin de petequias luego de unos
minutos.
VN: Hasta 5 petequias en un circulo de 5 cm de
dimetro. Se informa la positividad en cruces

HEMOSTASIA PRIMARIA
ADHESIVIDAD
PLAQUETA
SUPERFICIE

vW

In Vivo : Borchgrevink

(Acta Med Scand

1960, 168:157)

In Vitro : Hellem II (superficie de

vidrio)
Scand J Haemat 1970, 7: 37

HEMOSTASIA PRIMARIA
ADHESIVIDAD

In Vivo : Borchgrevink
Adhesividad (%)= 100 *( RT0 RT2 / RT0 )
RT0 : recuento de Pq. de muestra de sangre venosa
extrada con EDTA
RT2 : recuento de Pq. Luego de 2 min de TS.
VN: 30-70%

ADHESIVIDAD: mtodo de
Sangre enteraHellen II
Columna: tubuladura de PVP 3mm dimetro,
rellena con perlas de vidrio de 0.5mm dimetro,
1.3 g por columna.
Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg.

columna

cp
EDTA 2%

bomba

sp
EDTA 2%

%Adh = 100
VN = 27- 70%

SP- CP
SP

HEMOSTASIA PRIMARIA
AGREGACIN
La agregacin plaquetaria es el
resultado final de un complejo
proceso metablico. Cuando el
endotelio se daa se exponen una
serie de agonistas capaces de activar
a las plaquetas, estos son el colgeno
de la pared vascular, la trombina
generada, la adrenalina y el ADP.
La agregacion plaquetaria in vitro se
define como la interaccion Pq-Pq

Agregacin plaquetaria in vitro

Mtodo ptico (Born,

1980)
Mtodo potenciomtrico
IIHEMA-ANM
(Challen, 1982)

Condiciones del ensayo:

- Sangre obtenida por puncin sobre citrato de sodio 3.8%
(1:9)
- Tubos de polipropileno
- Preparacin de plasma rico en plaquetas (PRP): 10 min a
150-200 rpm
- Preparacin de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min a
altas rpm.
- Ajustar concentracin del PRP con PPP: 250 300 109/ m3
- Tapar tubos para evitar cambios de pH
- Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs
posteriores a la extraccin.

AGREGACI
ON
Agonistas panel de rutina:
ADR: 10 uM ( adrenrgicos)
Col: 1 ug /ml 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa)
AA: 0.5 mM (receptor de Tx)
ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12)
Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW
tipo II)
Agonistas especiales
TRAP6 : PAR1, PAR4
U46619: anlogo de TX
Endoperxidos cclicos: actividad Tx sintaza

AGREGACI
ON

COAGULACIN

HMWK

MI

VII

XII
PK
XI
IX

ME

VIII

X
V
II
I

TC

TOMA DE MUESTRA
Anticoagulante: Citrato trisodico 3.2 o 3.8 %
No se aconseja utilizar sangre capilar.
La sangre venosa debe ser obtenida por puncin rpida
y precisa, evitando la formacin de espuma, el xtasis
venoso y la contaminacin con tromboplastina tisular,
(torniquete menos de un minuto)

TOMA DE MUESTRA
La sangre arterial debe ser obtenida por puncin
directa no traumtica.
Evitar la extraccin por catter, de ser indispensable,
realizar la extraccin con doble jeringa y descartar los
primeros 5 a 10ml de sangre.

TOMA DE MUESTRA
No se aconseja la extraccin con tubos de vaco,
aunque estos tubos pueden utilizarse para colocar la
sangre una vez abiertos.
Relacin ac / sgre, 1+9

TOMA DE MUESTRA

La relacin Anticoagulante / Sangre vara cuando el Hto. se

encuentra fuera del rango de 25 50%. Para calcular el
citrato a utilizar se usa la siguiente frmula:
Sangre entera en ml = 9 x citrato de Na en ml x 0,55
1 Hto en (v/v)

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

Cualquiera sea la distancia se remitirn las

muestras congeladas, con hielo seco, y en
un recipiente adecuado para su
conservacin, acompaadas de controles
normales procesados de igual forma.

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

Descartar los tubos que no mantengan

adecuada relacin ac/ sgre , y aquellos que
muestren hemlisis visible.
Centrifugar las muestras y separar los plasmas
con pipetas de plstico lo mas rpido posible.

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

a-Plasma citratado rico en plaquetas (prp)

centrifugar 5-10 min. a bajas rpm, separar el
plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 hs
b-Plasma citratado pobre en plaquetas (ppp)
centrifugar 10 min. a 3000 rpm, utilizar dentro de las
4 hs .

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

c- Preparacin de pool de plasmas normales

Se extrae sangre a como mnimo 10 sujetos
normales con bsico de coagulacin normal , y
se prepara ppp se fracciona y se conserva
a -80 C hasta 6 meses o solo 1 mes si se
guarda a -20 C

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
d-Preparacin de plasma adsorbido
Es plasma desprovisto de los factores vitamina K
dependientes, factores II ,VII, IX y X, que quedan
adsorbidos en sulfato de bario.
A partir de sangre extrada con oxalato de sodio en
relacin 1+9, se prepara ppp y se mezcla con sulfato
de Ba (50 mg por ml de plasma). Se incuba a 37C 15
min. ,se centrifuga dos veces y se recoge el
sobrenadante, que debe tener un TP mayor de 60 seg.
El plasma adsorbido posee los factores:
I,V,VIII,XI,XII

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
e-Preparacin de suero
Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI Y XII.
Se obtiene dejando coagular la sangre en tubo de
vidrio por espacio de 4 hs. Se centrifuga 15 min. a
3000 rpm .Se puede mantener a 4C por 24 horas o
fraccionar y congelar

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
f-Preparacin de plasma envejecido
Deficitario en factor V, se extrae sangre con oxalato de
sodio 0.1 M en proporcin 9+1, se obtiene ppp, y se
lo coloca en un enlenmeyer a 37c.
Se controla el decaimiento de la actividad del factor
V mediante el TP hasta un valor de 60 seg. Alicuotar
y guardar a -20C

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TPR
-Tiempo de plasma recalcificado
-Se basa en reiniciar la cadena de activacin del
sistema de la coagulacin al agregar un exceso de
iones calcio al plasma citratado y se mide el tiempo
que tarda en coagular
-Evala numero y funcin de plaquetas
Muestra: prp
Reactivo: cloruro de calcio 0,025 M

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TPR
Procedimiento: incubar unos segundos a 37C 200 ul
de prp y disparar el cronometro al agregar cloruro de
calcio 0,025 M, medir en intervalos de 30 seg el
tiempo que tarda en coagular
Se realiza por duplicado y se informa el promedio
VN: 1-3 min.
Prolongado: Dficit de factores de la va intrnseca y
del numero y funcin de las plaquetas.

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TP
-Tiempo de protombina
-Mide el tiempo de coagulacin de un plasma
citratado en presencia de tromboplastina (FT) e iones
calcio
-Evala la va extrnseca
-Se usa para monitorear la terapia con ACO
-Refleja cambios en los niveles de los factores
II,VII,X,V
-En cuanto al fibringeno solo una disminucin por
debajo de 50 mg lo afectan.

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TP
Tromboplastina
Apoproteina + Fosfolipidos
Fuentes: plantas, cerebro de conejo, ratn o mono,
recombinarte (humana) a la que se le agregan
fosfolipidos naturales o artificiales

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TP
Muestra: plasma citratado ppp
Reactivo: tomboplastina calcica
Procedimiento: incubar 100 ul de ppp 1 min a 37C,
disparar el cronometro al agregar 200 ul de reactivo a
37C, medir el tiempo de coagulacin
Los resultados se informan:
-En segundos informando entre parntesis el valor del
testigo( 11 recombinante, 12-14 de conejo)

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TP
-En % de actividad o tasa de trombina:
Se preparan diluciones de un pool de plasmas
normales y se determina el TP por duplicado, con
los datos se grafica una curva, en papel doble log, de
TP vs % de actividad, asignando al pool de normales
el 100% de actividad.
Teniendo el TP del paciente se busca en la curva el %
o tasa que le corresponde.
VN: 70-100%

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TP
Valores prolongados se observan en:
-Deficiencia congnita o adquirida de uno o varios de
los siguientes factores: II,V,VII,X
-Hipofibrinogenemia
-Enfermedad heptica
-Deficiencia de vitamina K
-Tratamiento con ACO
-Presencia de inhibidores de alguno de los factores
involucrados

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN

APTT
-Tiempo de tromboplastina parcial activado
-Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma
citratado ppp en presencia de tromboplastina parcial,
un activador, e iones calcio.
-Evala la va extrnseca
-Se utiliza para controlar la terapia de anticoagulacin
con heparina

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
APTT
Tromboplastina parcial: fosfolipidos de la
tromboplastina que se obtienen de tejido animal o de
fuentes vegetales (cefalina)
Activador :- particulado, caoln, celite, slica
micronizada.
-no particulado, ac. Elagico

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
APTT
Muestra: plasma citratado ppp
Reactivos: -cefalina - caolin
-cloruro de calcio 0.025 M
Procedimiento: incubar100 ul de ppp con 100 ul de
rvo a 37C durante 3 min, disparar el cronometro al
agregar 100 ul de cloruro de calcio 0,025 M, medir el
tiempo que tarda en coagular.
VN: 30- 40 seg.

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
APTT
Valores prologados se observan en:
-Dficit congnito o adquirido de factores II, V, VIII,
IX, X, XI, y XII
-Tratamiento con heparina
-Presencia de inhibidores
-Tratamiento ACO instaurado

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TT
Evala la etapa de fibrinoformacin midiendo el tiempo
que tarda en coagular el plasma citratado en presencia
de trombina, independientemente de las alteraciones
que podran afectar el MI o el ME

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TT
Muestra: ppp
Reactivo: solucin de trombina comercial (liofilizada) o
preparada a partir de plasmas de dadores, se ajusta la
dilucin de manera tal que el testigo sea
aproximadamente 15 seg
Procedimiento: incubar 100ul de muestra 1 min a 37 C
agregar 100 ul de trombina diluida y tomar el tiempo
que tarda en coagular.

PRUEBAS PARA EVALUAR LA

COAGULACIN
TT
Se considera prolongado cuando el plasma del paciente
difiere en mas de 4 segundos con el normal.
Valores prolongados se observan en :
-Niveles bajos de Fibringeno o Disfibrinogenemia
-Tratamiento con heparina no fraccionada
-Presencia de inhibidores adquiridos

PRUEBAS ALTERADAS
Dficit de factores
o presencia de inhibidores?
Mezclas con plasma normal (1+1)
corrige
cuantificacin de
factores

no corrige
deteccin de
inhibidores

PRUEBAS DE CORRECCIN
Para orientarnos sobre las causas que provocan la
alteracin de las pruebas podemos realizar
correcciones mezclando partes iguales del plasma en
estudio con:
- Plasma adsorbido: aporta los factores
I,V,VIII,XI,yXII.
-Suero: aporta los factores VII,IX,X,XI, yXII
-Plasma envejecido: carece de factor V

DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA EXTRINSECA
II, V, VII, X
TP
plasma
patrn/pool de plasma
normal(curva de
calibracin)
paciente diluido
plasma deficiente en el
factor a medir
tromboplastina - calcio

seg

seg
pac

% pac

% factor

DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA INTRINSECA
VIII, IX, XI, XII
KPTT
plasma
patrn/pool de plasma
normal (curva de
calibracin)
paciente diluido
plasma deficiente en el factor
a medir
cefalina - kaoln
Cl2Ca

seg

seg
pac

% pac

% factor

DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA

FINAL : FIBRINOGENO (mtodo
gravimtrico)
trombina
fibringeno

fibrina

-Se recoge el coagulo con varilla de vidrio

-Se lava con agua destilada
-Se deshidrata con alcohol, y se deja secar a 80 C
-Se pesa la fibrina en balanza de precisin, la masa final
de fibrina es directamente proporcional a la
concentracin de fibringeno

DOSAJE DE FACTORES DE LA
VIA FINAL :FIBRINOGENO
(mtodo de Claus)
mtodo bsico = TT
plasma
patrn mg/dl (curva de
calibracin)
paciente

seg

seg
pac

trombina
mg/dl pac

mg/dl

SANGRADO SIN ALTERACION DE LA

PRUEBAS GLOBALES
Determinacin de factor XIII
La fibrina formada en ausencia de factor XIII se
disuelve en urea 5 M
Procedimiento: Se hace coagular 200ul de ppp con
200ul de cloruro de calcio 0.025 M, y 100 ul de
trombina, incubar 30 min a 37C agregar solucin de
urea 5 M, desprender el coagulo de las paredes y
dejar a temperatura ambiente 24 horas. Observar a los
30min, 1,2,4,y 24 horas la disolucin del coagulo
Valor normal: no disolucin a las 24 horas.

FUNCIONES DEL SISTEMA

FIBRINOLITICO
ELIMINACIN DE LA FIBRINA QUE QUEDA
ADHERIDA A LAS PAREDES DE LOS VASOS
DESPUS DE LA COAGULACION (intravascular)
INTERVIENE EN LAS REPARACIONES
HSTICAS
INTERVIENE EN LA ACTIVACION DE LOS
MACROFAGOS (extravascular)

SISTEMA FIBRINOLTICO
Est compuesto por una
enzima clave: plasmina (Plm),
cuyo precursor inactivo es el
plasmingeno ( Plg ).
Esta activacin puede
producirse por :
Activador tisular del
plasmingeno: t-PA
Activador tipo uroquinasa: uPA
Factor XIIa y calicrena

SISTEMA FIBRINOLTICO
La plasmina produce clivaje tanto del fibringeno como de la fibrina.
_____________________________________________________
Degradacin del fibringeno.(Fibrinogenolisis)
fragmentos X, Y, D, E ( PDF)
Fisiolgicamente esto no ocurre ya que las pequeas cantidades de
plasmina que se generan son inhibidas por la antiplasmina.
_____________________________________________
Degradacin de fibrina. (Fibrinolisis)
fragmentos de distinto PM , en su mayora fragmento D
entrecruzado ( D-Dmero)
El hallazgo de Dmero D aumentado implica que hubo formacin de
fibrina entrecruzada y posterior lisis de la misma.

EVALUACION DEL MECANISMO

FIBRINOLTICO
PRUEBAS GLOBALES
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO.
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE
ENTERA DILUIDA.
TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS

EVALUACION DEL MECANISMO

FIBRINOLTICO
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO
2 ml de sangre.Incubar a 37 C
Tomar el tiempo de lisis.
Se informa el tiempo de lisis
Normal un tiempo mayor de 24 hs
< de 24 hs--- aumento de la act.fibrinolitica
< 6hs----asociado a hemorragias.
Poco sensible.Sirve en los def. de alfa2-AP

EVALUACION DEL MECANISMO

FIBRINOLTICO
TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE
ENTERA DILUIDA
Sangre diluida 1/10 en buffer fosfato y con el
agregado de trombina.30 min en heladera
Dejar a 37 C.Examinar cada 10 min.Anotar tiempo
de lisis.
Resultado variable. < de 2 hs ---Hiperfribrin.
> de 20 hs----Hipofibrinolsis
Evaluar junto a la lisis de euglobulinas

EVALUACION DEL MECANISMO

FIBRINOLTICO
LISIS DE EUGLOBULINAS
La dilucin y acidificacin del plasma provoca la
precipitacin de las euglogulinas( fraccin proteica
que contiene el fibringeno, el plasmingeno, los
activadores del plasmingeno y la plasmina), luego se
resuspende en buffer alcalino, se coagula y se incuba
a 37C, para registrar el tiempo de lisis del cogulo,
este procedimiento elimina los inhibidores de la
fibrinolisis.

EVALUACION DEL MECANISMO

FIBRINOLTICO
LISIS DE EUGLOBULINAS

El tiempo de lisis del coagulo es inversamente

proporcional a la actividad fibrinoltica del plasma

EVALUACION DEL MECANISMO

FIBRINOLTICO
Procedimiento: en tubo de vidrio se agregan 4ml de
agua destilada,70ul de acido actico, y 250ul de ppp,
se mezcla y deja 30 min a 4 C, se centrifuga 5 min a
bajas rpm, en el sobrenadante quedan los inhibidores
que se descartan, se deja escurrir y se resuspende con
solucin de borato de sodio en bao a 37C hasta
disolucin y se coagula agregando cloruro de calcio
Se registra el tiempo desde la coagulacin hasta la
disolucin total del coagulo.

EVALUACION DEL MECANISMO

FIBRINOLTICO
VN: el coagulo se lisa entre 1h 30 min y 4 hs.
Tiempos de lisis inferiores demuestran un aumento de la
fifrinolisis a expensas del aumento de los activadores
del plasmingeno, pudindose asociar con
hemorragias.
Tiempos de lisis superiores reflejan disminucin de la
actividad fibrinoltica y pueden asociarse a perdidas
embriofetales.
La prueba se ve afectada por los niveles de fibringeno
y de plasmingeno.