Estrategia en la

sntesis de pptidos

El desafo de la sntesis de pptidos

La unin de enlaces peptdicos entre aminocidos no es difcil:
Existen muchos mtodos para obtener amidas (el enlace
peptdico es un enlace tipo amida) a partir de aminas y cidos
carboxlicos
El desafo es conectar los aminocidos (estructuralmente
bifuncionales) en la secuencia correcta.
Por ejemplo, si permitimos la formacin al azar de enlaces
peptdicos en una mezcla de fenilalanina y glicina, obtendramos
4 dipptidos:
H
H

N
H

OH

H
H

L-Phenylalanine

N
Glycine

OH

PhePhe
Phe

GlyGly

PheGly

Gly

Productos posibles de la condensacin

de fenilalanina y glicina
H
H

N
H

OH

H
H

N
Glycine

OH

H2N
H

H
OH

N
H

H
N

H2N
O
Gly-Phe

OH

Gly-Gly O

Phe-Gly

L-Phenylalanine

H2N

H
OH

H
N

H2 N
O
Phe-Phe

OH

Sntesis de pptidos. Paso 1:

Proteccin

1.Limitar el nmero de reacciones posibles mediante la

proteccin o bloqueo del grupo amino de un
aminocido y el grupo carboxilo del otro aminocido.
H
PG

N
H

OH

H
H

PG
O

O-Protected
Glycine
N-Protected
L-Phenylalanine

N-Nucleophile

C-Electrophile
Al proteger las cadenas laterales de los aminocidos tambin se est evitando
que estos reaccionen con los grupos amino o carboxilo de otros aminocidos, o
que den lugar a reacciones secundarias. Los grupos protectores tambin protegen
el carbono alfa de ser susceptible a racemizacin.

PG
protecting
group
Grupo protector

Sntesis de pptidos. Paso 2:

Acoplamiento

2. Acoplamiento de dos aminocidos protegidos:

H
PG

N
H

OH

H
H

Grupo protector
(Protecting group)

PG
O

Peptide
Coupling
H
PG

El grupo protector debe ser qumicamente estable

en las condiciones en las que se da la sntesis
peptdica

N
H

N
H

O
O

PG

PG-Phe-Gly-PG

Sntesis de pptidos. Paso 3: Desbloqueo global,

Remocin del protector

3. Desbloqueo del grupo amino en el N-terminal y del

grupo carboxilo en el C-terminal:
H
O
PG

N
H

N
H

PG

Deprotection
O
H3N
H
El grupo protector debe ser fcilmente removible
en condiciones suaves que no alteren la
formacin del enlace peptdico al final o en
fases intermediarias de la sntesis.

Phe-Gly

N
H

O
O

El llevar a cabo los tres pasos para la sntesis de un pptido en

particular, es mejor que permitir la formacin de estos pptidos
al azar?
O
H2N
H

H
OH

N
H

Gly-Gly

Phe-Gly

H
N

H2N
O
Gly-Phe

H2N

O
OH

H
OH

H
N

H2N
O

OH

Phe-Phe

SI la sntesis dirigida es mucho ms fcil que la purificacin,

por lo que evitaramos la etapa de remover los pptidos
sintetizados que no nos interesa

Proteccin del grupo

amino

Qu estamos tratando de lograr

mediante el bloqueo temporal del
grupo amino?

Los grupos amino pueden comportarse como nuclefilos y se

someten a reaccin con derivados de cidos carboxlicos. El
tomo de nitrgeno en amidas es mucho menos nucleoflica.
Como resultado, las amidas derivadas de aminas pueden ser
vistas como grupos protectores.

Amine

Amide Derivative

O
H2N

Nucleophilic
Atom

OR

H
N

R2

O
Non-Nucleophilic
Atom

OR

Tipos de protectores de aminas

Tipos de protectores de aminas

Benciloxicarbonil. Tambin asignado con la

abreviacin Z, este mtodo de proteccin
es
el desarrollado por Bergmann y Zervas. Se
basa en la acilacin de una amina con
cloruro de
Carbobenzoxilo para dar una amida

Sntesis de pptidos: Grupos protectores de aminas

1.

Los grupos amino se pueden proteger comnmente mediante su conversin en

amidas. El tomo de nitrgeno en una amida no se comporta como nuclefilo y no
reaccionar con grupos carboxilos.

2.

Benciloxicarbonilo (C6H5CH2O) es un grupo protector muy utilizado. Se abrevia

como Z o Cbz.

3.

El bloqueo con Cbz se lleva a cabo mediante el tratamiento de un aminocido con

cloruro de benciloxicarbonilo, para insertarse en el N-terminal del grupo amino como
radical benciloxicarbonilo.
O
O

O
Cl

Benzyloxycarbonyl
chloride
(Cbz-Cl)

N
H

Benzyloxycarbonyl
group

Grupos protectores de aminas:

Benciloxicarbonilo
O
O
O

H3N

O
O
O

H3N
H

Cl

1. NaOH
H2O

Cl

2. H3O+

(85%)
Cloruro de
benciloxicarbonilo
O
(Cbz-Cl)

O
Fenilalanina
H (Phe)
N
O

(85%)

OH

1. NaOH
H2O

2. H3O+
Grupo benciloxicarbonilo

H
N

Complejo Cbz-phe

OH

Remocin de grupos Cbz

Una ventaja de la utilizacin de grupos benciloxicarbonilos como protectores es que
son muy fciles de removerse mediante:
a) Hidrogenlisis cataltica en condiciones extremadamente suaves
b) Rompimiento del enlace con HBr en cido actico
Ambos tratamientos rompen el enlace tipo ter carbono-oxgeno benclico (el cul es
muy dbil) aunque mediante diferentes mecanismos

Hidrogenlisis (hidrogenacin
cataltica) de grupos Cbz
Formacin de ster etlico (-COOCH2CH3 -COOet)

Previa esterificacin con alcohol etlico

en presencia de HCl para la formacin
de un ster etlico
O

H
N

N
H

+ CH3CH2OH

H
N

N
H

OEt
hidrogenacin

La
cataltica usualmente es
llevada acabo con 80% de cido actico y 10%
H
O
de paladio a presin y temp amb. Mtodo
Toluene
O
confiable.
Limitante: el catalizador
H puede ser
(volatile)
Carbamic
Acid
OEt
(Very Unstable)
OEt
degradado por azufre HO
(si en Nla secuencia
N
H H
peptdica se encuentran aminocidos
azufrados
O
O
Cys, Met).
N
H

Hidrogenlisis:
O
H2C

H
N

HO
H

H2C

ster etlico es muyHestable a

HO
N
hidrogenlisis
N
H

OE
O

Carbamic Acid
(Very Unstable)

Spontaneous
decarboxylation

H2, Pd/C
solvent

H2C

O
H2, Pd/C
solvent

H
N

HO

Toluene
(volatile)

O-CH2CH3
OEt

N
H

H2, Pd/C
solvent

Complejo Cbzaminocido

Toluene
(volatile)

HCl

OH
OEt

H
N

N
H

H2N

OEt
O

Carbamic Acid
(Very Unstable)

H
O
C
O

N
H

OEt
O

(100%)

El cido carbmico
obtenido
de
la
hidrogenlisis sufre
descarboxilacin
espontnea
(liberacin de CO2)

Remocin de grupos Cbz por mediacin

cida
Se parte, al igual que la hidrogenlisis, de previa esterificacin con alcohol etlico
en presencia de HCl para la formacin de un ster etlico
O

H
N

N
H

OEt
O
HBr
acetic acid

Conveniencia: Alta, ya que la mayora de los

pptidos protegidos son solubles en cido cetico,
especialmente cuando hay una alta concentracin
de HBr.
Benzyl
bromide
(volatile)

O
Br H3N
H2C

Br

N
H

O
C
O

OEt
O

(82%)

Recuperacin
fcil:
El
producto
desprotegido puede ser precipitado como
una sal de hidrobromuro cuando se le
agrega ter.

Limitantes: La integridad de algunos pptidos sintetizados puede verse

daada, especialmente si entre los aminocidos que conforman al producto se
encuentran algunos con cadenas laterales susceptibles, como es el caso de
triptfano, tirosina y metionina.

Amine Protecting Groups: tertButyloxycarbonyl

O
O

O
N
H

tert-Butyloxycarbonyl
group

O
O

O
O

Di-tert-butyl dicarbonate
(Boc 'anhydride')
O
O

Cl

tert-Butyl chloride
(instablity limits use)

tert-Butyloxycarbonyl is Abbreviated to
Boc
H
N

O
O

OH

Boc-Phe

Boc

H
N

OH

Cleavage of Boc Groups

The tert-butyloxycabonyl protecting group is
readily removed by treatment wit strong,
anhydrous Brnsted acids:
a) cleavage with trifluoroacetic acid in
methylene chloride
b) cleavage with HBr in acetic acid
Both reagents cleave the quaternary carbonoxygen ether bond by an acid-mediated
elimination reaction.

Acid-Mediated Cleavage of Boc Groups

O

H
N

OEt

N
H

O
O
F3C

OH

O
F3C

Butene
(volatile)
H

O
C

H3C

CH3

trifluoroacetic
acid

O
O

H3N
H

N
H

OEt
O

(high yield)

27.16
Carboxyl Group
Protection

Peptide Synthesis: Carboxyl Protecting

Groups
Carboxyl groups are normally protected
as esters.
Deprotection of methyl and ethyl esters
is by hydrolysis in base.
Benzyl esters can
hydrogenolysis.

be

cleaved

by

Simultaneous Hydrogenolysis
of Cbz Group and Benzyl Ester
O

H
N

N
H

O
H2, Pd/C
solvent
H
N

HO
H2C
Toluene
(volatile)

N
H

OH
O

Carbamic Acid
(Very Unstable)

Simultaneous Hydrogenolysis
of Cbz Group and Benzyl Ester
H
N

HO
O

N
H

OEt
O
Spontaneous
decarboxylation
O
H2N
H

N
H

O
C
O

(87%)

OEt
O

27.17
Peptide Bond
Formation

Peptide Synthesis: Forming Peptide

Bonds
The two major methods are:
1. coupling of suitably protected
amino acids using N,N'dicyclohexylcarbodiimide (DCC)
2. via an active ester of the N-terminal
amino acid.

N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) is
a Powerful Dehydrating Agent
H

O
R1

O
R1

H
O

Very high
temps

R2

R2
O
N
H

O
R1

N
H

'H2O'

-H2O

R2

N,N'-dicyclohexylcarbodiimide

H
N

Amide

N
H

N,N'-dicyclohexylurea

Peptide Coupling is a Condensation

Reaction

2. Couple the two protected amino

acids.
H
O
PG

N
H

OH

H
H

Peptide
Coupling
H
PG

PG

-H2O

N
H

N
H

O
O

PG

DCC-Mediated Peptide Coupling

2. Couple the two protected amino
acids.
H

Cbz

N
H

OH

Et

DCC, CHCl3
H
Cbz

N
H

N
H

(83%)

O
O

Et

Mechanism of DCC-Promoted
Coupling
H
Cbz

N
H

OH

1,2-Addition

H
Cbz

N
H

N
O

N
H

O-Acylisourea
derivative

O-Acylisoureas are
Powerful Acylating
Agents
The O-acylisourea
intermediate
formed by addition
of the Cbzprotected amino
acid to DCCI is
similar in structure
to an acid
anhydride and acts
as an acylating
agent.

H
Cbz

N
H

O-Acylisourea
Derivative

O
H3C

O
O

CH3

Acid
Anhydride

Mechanism of DCC-Promoted
Coupling
H
Cbz

N
O
H

Attack by the
amine function
of the carboxylprotected
amino acid on
the carbonyl
group leads to
nucleophilic
acyl
substitution.

N
H

1,2-Addition
then
Proton Transfer

OEt
H
Cbz

OH

N
H

N
O

N
H
Unstable
Intermediate
OEt

Mechanism of DCC-Promoted
Coupling
H
Cbz

OH

N
H

Attack by the
amine function
of the carboxylprotected
amino acid on
the carbonyl
group leads to
nucleophilic
acyl
substitution.

Unstable
Intermediate

N
H

OEt

H
Cbz

O
N
H

Elimination
O

N
H

N
H

N,N'-dicyclohexylurea

N
H

OEt
O

Dipeptide

Peptide Synthesis: Forming Peptide

Bonds
The two major methods are:
1. coupling of suitably protected
amino acids using N,N'dicyclohexylcarbodiimide (DCCI)
2. via an active ester of the N-terminal
amino acid.

Peptide Synthesis: Active Ester Method

A p-nitrophenyl ester is an example of an
"active ester.
p-Nitrophenyl is a better leaving group
than methyl or ethyl, and p-nitrophenyl
esters are more reactive in nucleophilic
acyl substitution.
O
N+

O
O

4-Nitrophenyl
(PNP) Ester

O
is a more powerful
acylating agent than......

Alkyl

Alkyl Ester

Peptide Synthesis: Active Ester Method

H
Cbz

NO2

O
O
H
H

1,2-Addition
then
Proton Transfer

OEt
H
Cbz

NO2

OH

N
H

O
Unstable
Intermediate
OEt

Peptide Synthesis: Active Ester Method

H
Cbz

NO2

OH

N
H

Unstable
Intermediate

Elimination

OEt

H
Cbz

O2N

OH

para-Nitrophenol

N
H

N
H

OEt
O

Dipeptide

27.18
Solid-Phase Peptide
Synthesis:
The Merrifield Method

Solid Phase Peptide Synthesis

In solid-phase synthesis, the starting material
is bonded to an inert solid support.
Reactants are added in solution.
Reaction occurs at the interface between the
solid and the solution. Because the starting
material is bonded to the solid, any product
from the starting material remains bonded as
well.
Purification involves simply washing the
byproducts from the solid support.

Polystyrene is the Basis for the Solid

Support
H

C
H

H H
C

C
H

H H
C

C
H

H H
C

C
H

H H
C

H
C

The solid support is a copolymer of styrene and

divinylbenzene.
It is represented above as if it
were
polystyrene.
Cross-linking
with
divinylbenzene simply provides a more rigid
polymer.

Functionalization of Polystyrene

Treating
the polymeric support with
chloromethyl methyl ether (ClCH2OCH3) and
SnCl4 places ClCH2 side chains on some of
the benzene rings.

Chloromethylation of Polystyrene

Cl

Cl

CH2

Cl

C
H2

CH2

Me

SnCl4

Solid Phase Peptide Synthesis

Cl

CH2

Cl

CH2

The side chain chloromethyl group is a

benzylic
halide,
reactive
toward
nucleophilic substitution (SN2).

Solid Phase Peptide Synthesis

Cl

CH2

Cl

CH2

The chloromethylated resin is treated with

the Boc-protected C-terminal amino acid.
Nucleophilic substitution occurs, and the
Boc-protected amino acid is bound to the
resin as an ester.

Merrifield Procedure
CH2

CH

CH2

CH

CH2

BocNHCHCO
R

CH

CH2

CH2Cl

CH

Merrifield Procedure
CH2

CH

CH2

CH

CH2

O
BocNHCHCO
Next, the Boc
protecting group
is removed with
HCl.

CH

CH2

CH2

CH

Merrifield Procedure
CH2

CH

CH2

CH

CH2

O
DCCI-promoted
coupling adds
the second
amino acid

H2NCHCO
R

CH

CH2

CH2

CH

Merrifield Procedure
CH2

CH

CH2

CH

CH2

O
BocNHCHC
R'

CH

CH2

CH

CH2

NHCHCO
R

Remove the
Boc protecting
group.

Merrifield Procedure
CH2

CH

CH2

CH

CH2

O
H2NCHC
R'

CH2

CH

CH

CH2

NHCHCO
R

Add
the
next amino
acid
and
repeat.

Merrifield Procedure
CH2

CH

CH2

O
+
H3N peptide

CH

CH2

C NHCHC
R'

CH

CH2

CH

CH2

NHCHCO
R

Remove the
peptide from the
resin with HBr in
CF3CO2H

Merrifield Procedure
CH2

CH

CH2

O
+
H3N peptide

CH

CH2

C NHCHC
R'

NHCHCO
R

CH

CH2

CH2Br

CH

Merrifield Procedure
Merrifield automated his solid-phase method.
Synthesized a nonapeptide (bradykinin) in
1962 in 8 days in 68% yield.
Synthesized ribonuclease (124 amino acids)
in 1969.
369 reactions; 11,391 steps
Nobel Prize in chemistry: 1984