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TECHNIQUES SPECIALES

CULTURES CELLULAIRES

CRIOFRACTURE

CENTRIFUGATION (FRACTIONATION
CELLULAIRE)

TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

TECHNIQUES LCTROPHORTIQUES

DIFFRACTOMTRIE DE RAYONS X

CULTURES CELLULAIRES
Definition:

La culture cellulaire dsigne un ensemble de techniques utilises pour faire crotre


des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but
d'exprimentation scientifique ou de fcondation in vitro

Les cellules mises en culture peuvent tre:

1) des micro-organismes libres (bactries ou levures )


2) des cellules "saines" prleves frachement d'un organisme (biopsie ,...), on parle alors de "
culture
primaire ". Ces cellules ne peuvent habituellement pas tre maintenues en culture
indfiniment,
notamment cause de leur nombre limit de divisions (limite de Hayflick ).
3) des cellules ayant une capacit de division non limite (on parle d'"immortalit en culture").
4) des lignes cellulaires . Les lignes sont soit des cellules cancreuses, soit des cellules en
voie de
cancrisation , soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.
5) des tranches d'organes (d'paisseur optimise selon le tissu)

Conditions de travaille

optimisation des conditions "atmosphriques" (ajout d' oxygne)


optimisation de la composition des milieux nutritifs (ajout de
certaines hormones)
optimisation des supports (composition en biomolcules)
culture sous agitation
co-culture avec des cellules "nourricires"
culture sur des tissus pralablement "tus" par un procd de
conglation/dconglation
inclusion dans des gouttelettes d'alginate

Installation des instruments striles

Transfert dans un nouveau milieu pour


fragmentation de l'embryon

Introduction dans le flacon de


culture d'une suspension de
cellules d'embryons l'aide d'une
pipette strile

Aplication pratiques:
1.
2.
3.

Letude des caracteres morphologiques et biologiques


Letude des biologie tissulaire
Letude in vivo des cellule:

les effects des hormones ou des facteurs de croissance

interaction entre different types des cellule

Mise l'tuve des flacons


pendant 24 heures
37C

Criofracture

CENTRIFUGATION
(FRACTIONATION

CELLULAIRE)

La centrifugation est une technique utilisant la force centrifuge pour


sparer des fluides de densits diffrentes ou pour isoler des lments
solides en suspension dans un fluide.
Permet de sparer les lments d'un mlange en le faisant tourner
grande vitesse.

Rotors a angle fixe pour les sparations les plus


simples entre culot (cellules, organites, membranes,
protines plus ou moins agrges selon les cas) et le
surnageant. Utilis surtout pour des sparations
squentielles, des vitesses de rotation croissantes.

TECHNIQUES
CHROMATOGRAPHIQUES
Chromatographie: est une mthode physique de sparation base

sur les diffrences d'affinits des substances analyser l'gard de


deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile.
Selon la technique chromatographique mise en jeu, la sparation des
composants entrans par la phase mobile, rsulte soit de leur
adsorption et de leur dsorption successives sur la phase
stationnaire, soit de leur solubilit diffrente dans chaque phase.

Phase de cromatographie:

Phase stationnaire: phase fixe soit sur la surface intrieure d'une


colonne soit sur une surface plane.

Phase mobile: phase qui se dplace travers la phase stationnaire,


en entranant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec
la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.

Chromatogramme: graphique dune fonction de la concentration en


analyte en fonction du temps (ou du volume) dlution.
La chromatographie analytique est utilise pour identifier ou doser les
composs chimiques d'un mlange et apprcier leur concentration.
La chromatographie prparative est utilise pour purifier assez de
produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la
substance; c'est pourquoi, toute chelle, elle implique de collecter
des fractions.

TECHNIQUES
CHROMATOGRAPHIQUES

Classification:

classification selon la nature de la phase mobile:

la chromatographie en phase gazeuse (CPG) galement


appele CPV (chromatographie en phase vapeur);
la chromatographie en phase liquide (CPL);
la chromatographie en phase liquide haute performance
(CLHP);
la chromatographie en phase supercritique (CPS).

classification selon les interactions dveloppes par la


phase stationnaire:

la chromatographie d'adsorption / d'affinit;


la chromatographie de partage;
la chromatographie change d'ions;

TECHNIQUES
CHROMATOGRAPHIQUES

Chromatographie en phase liquide


La chromatographie en phase liquide (CPL) ou liquid chromatography
(LC) est une technique d'analyse quantitative, qualitative et sparative
principalement utilise dans le domaine de la chimie analytique comme outil
scientifique majeur mais aussi dans des domaines varis tels que la
chimie organique
et
la
biochimie.
Elle
recouvre
la
biochimie.
chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie sur papier , la
chromatographie en phase liquide en colonne ouverte
ou basse
pression,
et
la
chromatographie en phase liquide haute performance
(HPLC).
Ce type de chromatographie repose sur la sparation de composs entrans
par un liquide (phase
(phase mobile)
mobile) travers un solide divis (phase
(phase stationnaire)
stationnaire)
qui est soit plac dans un tube (colonne
(colonne chromatographique),
chromatographique), soit fix sur une
surface inerte.

Chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, une technique qui permet


de sparer des molcules d'un mlange ventuellement trs complexe de
nature trs diverses. Elle s'applique principalement aux composs gazeux ou
susceptibles d'tre vaporiss par chauffage sans dcomposition. Elle est de
plus en plus utilise dans les principaux domaines de la chimie.
Le mlange analyser est vaporis l'entre d'une colonne, qui renferme une
substance active solide ou liquide appele phase stationnaire, puis il est
transport travers celle-ci l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les
diffrentes molcules du mlange vont se sparer et sortir de la colonne les
unes aprs les autres aprs un certain laps de temps qui est fonction de
l'affinit de la phase stationnaire avec ces molcules.

TECHNIQUES
CHROMATOGRAPHIQUES
PRATIQUES)

La chromatographie sur papier

La chromatographie sur papier est une technique de


chromatographie en phase liquide .
Pour effectuer une telle sparation, une petite quantit de la
ou des solutions analyser est dpose sur le bord d'une
bande de papier de chromatographie. Cet chantillon est
adsorb par le papier; ce qui signifie que les molcules
interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance
rester au mme endroit.

Le papier est ensuite tremp dans un solvant (luant) comme


un mlange eau/thanol et plac dans un rcipient ferm.
Pendant que le solvant (luant) monte le long du papier par
capillarit, il rencontre l'chantillon et l'entrane.

Les diffrentes substances constituant l'chantillon migrent


diffrentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins
fortement avec le papier.

Le rsultat est appel chromatogramme. Le chromatogramme


est utilis pour comparaison avec d'autres analyses effectues
sur des substances connues et prises dans des conditions
identiques, pour identifier les substances de l'chantillon.

La chromatographie sur papier peut aussi constituer une


technique micro-prparative: pour rcuprer les produits ainsi
spars, les portions du papier o ils se situent sont
dcoupes et redissoutes ensuite. Les quantits rcuprables
sont de l'ordre du milligramme ou moins.

(APLICATION

TECHNIQUES
CHROMATOGRAPHIQUES
Application pratiques

La chromatographie est utilise:

dans les laboratoires d'analyses mdicales par exemple pour


valuer la quantit de vitamines dans le sang

dans le domaine sportif pour savoir si un athlte s'est dop

pour analyser les substances (poudres, liquides...) prleves sur


une scne de crime dans le cadre d'investigations en police
scientifique.

TECHNIQUES
LCTROPHORTIQUES

La technique de l'lectrophorse est fonde sur le dplacement d' ions


(molcules ayant perdu leur neutralit lectrique) sous l'effet d'un
champ lectrique. Du fait de leurs caractristiques propres et en
fonction des conditions de l'lectrophorse ces ions auront des
vitesses de migration diffrentes, ils vont donc se sparer les uns des
autres.

Les molcules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molcules
cationiques (+) se dplacent vers la cathode ().

Les diffrents types d'lectrophorses de zones sont souvent


nomms en fonction du type de support:
lectrophorse sur papier;
lectrophorse sur actate de cellulose;
lectrophorse sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide).

TECHNIQUES
LCTROPHORTIQUES
Gel d'lectrophorse

est utilise pour sparer les macromolcules


biologiques en fonction de leur taille et de leur
charge lectrique
le gel est constitu d'une matrice de polymre
baignant dans un tampon conducteur.
deux principaux polymres sont utiliss: l' agarose et
le polyacrylamide. On peut faire varier la
concentration de polymre par rapport celle du
tampon, ainsi que son taux de rticulation. Plus le
polymre est concentr et rticul, et plus la taille
des pores du gel est petite. On peut ainsi ajuster les
proprits du gel la taille des molcules analyser.

L'agarose
L'agarose est utilis des concentrations de 0,5%
(poids/volume) et permet de sparer des molcules de
grande taille, principalement de l'ADN
;
l'ADN ou de l'ARN
l'ARN;

2%
trs

Le polyacrylamide est utilis des concentrations de 4% 20%


(poids/volume) et permet de sparer des molcules plus petites:
protines, peptides et des fragments d'acides nucliques. On
peut aussi faire varier sa rticulation (taux de ramification) lors
de la polymrisation pour moduler les paramtres de sparation;

TECHNIQUES
LCTROPHORTIQUES
Extraction de l'ADN et sparation par lectrophorse

Matriel ncessaire

Le bleu de toluidine colore l'ADN

Cuves lectrophorse
Micropipetage de l'ADN

Dbut de migration de l'ADN dans


le champ lectrique

Rsultat de l'lectrophorse

DIFFRACTOMTRIE DE RAYONS X

La diffractomtrie de rayons X (DRX) est une technique


d'analyse base sur la diffraction des rayons X sur la matire.

La diffraction n'ayant lieu que sur la matire cristalline, on


parle aussi de radiocristallographie. Pour les matriaux noncristallins, on parle de diffusion.

L'appareil de mesure s'appelle un diffractomtre. Les donnes


collectes forment le diagramme de diffraction ou
diffractogramme.

Applications de la DRX
-

il est possible de la nature de chaque phase cristalline au sein d'un


mlange (mlange de poudre ou chantillon massif polyphasique),
condition d'avoir auparavant dtermin la signature de chaque phase.
- la mthode est qu'elle permet de distinguer les diffrentes formes de
cristallisation d'un mme compos. Cependant, elle ne peut
gnralement pas permettre d'identifier des composs amorphes. Cette
technique est donc complmentaire de l'analyse lmentaire.
- la mthode dterminer la identification de structures cristalline de lADN