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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL

ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS
QUMICAS
MICROBIOLOGA FARMACUTICA

ACTIVIDAD ANTIBACTERIAL DE NANOPARTCULAS


DE PLATA: SENSIBILIDAD DE DIFERENTES
SEROTIPOS DE Salmonella.

2/23/15

JESSICA MORA

Probar

la efectividad antimicrobiana
de nanopartculas de plata contra
Salmonella Enteritidis, Hadar y
Seftenberg e investigar las causas de
sus
diferentes
habilidades
de
sobrevivir desde un punto de vista
molecular.

Objetivo
2/23/15

JESSICA MORA

Salmonella

spp. es una de las principales causas de


enfermedades transmitidas en los alimentos en todo el mundo.
CADENA ALIMENTARIA

La cadena alimentara es el
conjunto de "eslabones" por los
cuales pasa el ALIMENTO.

DISMINUCIN
DE LA
PREVALENCIA

DISMINUCIN
EN EL
IMPACTO DE
LA SALUD

Introduccin
2/23/15

JESSICA MORA

Salmonella

Diferentes
caractersticas en
trminos de resistencia,
infectividad, morbilidad
y mortalidad

2 especies tiene el
gnero Salmonella
6 subespecies
Enterica
Mas de 2500
serotipos

Un serotipo es un tipo
de microorganismo
infeccioso clasificado
segn los antgenos
que presentan en su
superficie celular.

Bongori

CUALQUIER
SEROTIPO ES
CAPAZ DE
CAUSAR
ENFERMEDAD
ES
GASTROINTES
TINALES DE
DIVERSA
GRAVEDAD
EN HUMANOS

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MEDIDAS DE CONTROL
VACUNACIN
GESTIN ADECUADA DE HIGIENE
Comisiones de regulacin que obligan a los operadores de
negocios de comida a asegurar la ausencia de Salmonella en
algunos productos de origen animal

POR ESO ES INTERESANTE INVESTIGAR LA


EFICACIA Y APLICABILIDAD DE NUEVOS TIPOS DE
COMPUESTOS SEGUROS Y EFECTIVOS BIOCIDAS.

Introduccin (continuacin)
2/23/15

JESSICA MORA

CARACTERSTICAS DE NANOPARTCULAS DE PLATA


Ha sido usada por siglos como un antimicrobiano poderoso para infecciones.
Iones de plata y los compuestos basados en plata son altamente txicas para
microorganismos Gram negativos y Gram positivos.
Estudios previos han demostrado que formulaciones antimicrobianas en forma
de nanopartcula podran ser usados como efectivos bactericidas debido a su
mejorada actividad resultante debido a su alta proporcin superficie/volumen.
Nanopartculas exhiben fuertes efectos biocidas sobre diferentes tipos de
bacterias, e incluso bacterias resistentes a multidrogas.
Estos nanomateriales son capaces de unirse a la estructura de la membrana
celular, desestabilizando el potencial de membrana y causando el escape de
protones
Las nanopartculas tienen diferentes propiedades fsico qumicas, comparados
con los materiales a granel de la misma composicin, por lo cual existe la
posibilidad de que resulte en diferentes mecanismos de toxicidad en sistemas
biolgicos.

RESISTENCIA
En el uso de la plata como antimicrobiano se ha encontrado resistencia
determinante, pero poca informacin existe sobre la posibilidad que tenga el
mismo efecto de resistencia con nanopartculas de plata

Introduccin (continuacin)
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JESSICA MORA

A pesar de que la efectividad de las nanopartculas de plata han sido


probadas contra el gnero Salmonella, no estn disponibles hasta la
fecha datos concernientes de diferentes serotipos de Salmonella
incluyendo los que son de gran inters para humanos.
La presencia de genes resistentes a la plata en aislados de Salmonella
necesitan ser establecidos y la resistencia a las nanopartculas de plata
de bacterias resistentes a la plata deben ser confirmados.
Bacterias resistentes a la plata en la cadena alimentaria podra ser un
potencial problema de salud pblica ya que la plata es la clave en la
composicin de varios productos, especficamente dedicados a los
materiales en contacto con alimentos.
Datos de origen de estudios cientficos sobre la actividad biolgica de
nanopartculas son difciles de interpretar debido a las peculiares
caractersticas qumicas y fsicas de estas partculas, por eso es
fundamental proporcionar caracterizacin detallada de cualquier prueba
en nanopartculas.
Este estudio resulta importante para la seguridad alimentaria, ya que
los compuestos de plata son usados para desinfectar las plantas de
produccin de comida con el fin de eliminar patgenos que son
considerados de relevancia en salud pblica.

Importancia
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Nanopartculas
y productos
qumicos

Suspensin de nanopartculas de plata y su medio de control dispersante


Nanomaterial de referencia se integra a una solucin acuosa que contiene 4%
de tween 20
Nitrato de plata

Cepas
bacterianas

S. Enteritidis aislado de un hisopado de una capa de plumas de una gallina.


S. hadar aislado de un hisopado cloacal de pollos de engorde
S. Senftenberg aislado de un hisopado de una capa de plumas de una gallina.
Obtenidos de la coleccin de microorganismos patognicos de la OIE Reference
Laboratory for Salmonellosis.
Klebsiella pneumoniae clon ST258 usado como control positivo.

Prueba de
susceptibilidad
antimicrobiana

Fue
probada
su
actividad
antimicrobiana
con
diferentes
antibiticos usando una prueba de
microdilucin comercial (Sensititre
Salmonella plate).
MIC

Materiales y Mtodos
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Pureza qumica
de
nanopartculas
de plata

Tamao y
morfologa de
nanopartculas
de plata

Fue
evaluada
por
espectrometra de masas con
plasma
acoplado
iductivamente
(ICP-MS
ION300
Perkin
Elmer),
solucin de nanopartculas
diluida a 105mg/kg.
Despues se hizo digestin de
muestra por microondas por
triplicado.

Morfologa, tamao y estabilidad a


travs del tiempo fue analizado
mediante un microscopio
electrnico de transmisin (TEM) y
luz dinmica de dispersin (DLS)
Anlisis de distribucin de tamao
mediante un mtodo
semiautomtico, el anlisis implica
determinacin del rea y por
consiguiente el dimetro
asumiendo que la partcula es
circular.

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Ensayos de
susceptibilidad
de
nanopartculas
de plata

La efectividad de las nanopartculas de plata como un


antimicrobiano fueron determinadas probando el numero de
clulas bacterianas en el cultivo, las cuales se forman despus
de la incubacin en la presencia de nanopartculas de plata o
de nitrato de plata.

Prueba
molecular de
resistencia a la
plata

El total de DNA bacteriano fue


extrado por el mtodo de extraccin
ebullicin.
El total de ADN fue cuantificado
espectrofotomtricamente usando
SmartSpec .
La fraccin de DNA plasmidico fue
extraido

Transcripcin
reversa y
reaccin en
cadena de la
polimerasa

Cultivos celulares fueron


sedimentados y se aislo el total de
RNA. Su pureza se determin
espectrofotomtricamnete.
Para la sntesis de cDNA se uso RTPCR (primer requerido SilB)

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Caracterizacin
de
nanopartculas
de plata

Mediante
el
microscopio
de
transmisin
electrnica
(TEM),
la
suspensin
de
nanopartculas de plata se muestra como una
mezcla heterognea de partculas en tamao y
forma.
NANOPARTICULAS
DE PLATA
DISPERSADAS EN
AGUA

Resultados
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Comparar el
efecto
antibacteriano
de
nanopartculas
de plata y
nitrato de plata
sobre serotipo
de Salmonella
y se evala la
duracin de
este efecto con
el tiempo.
Se redujo el
contaje de
Salmonella
dependiendo
del serotipo, el
efecto fue
proporcional a
la dosis.

Salmonella Senftenberg

Ensayo de susceptibilidad con nanopartculas de plata

NPAg

AgNO3

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Salmonella Hadar

AgNO3

NPAg

Salmonella Enteritidis

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Cepas de Salmonella resistentes a NPAg


La perdida selectiva de efectividad antimicrobiana, dependiendo del serotipo de Salmonella,
de acuerdo a la hiptesis de la presencia de un mecanismo especficos de resistencia

Identificar si las 3 bacterias


presentan el gen SilB

Verificar el origen plasmidico

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Probar la expresin del gen SilB resistente en la cepa S. Seftenberg,


En presencia o ausencia de nanopartculas de plata y nitrato de plata

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Existe

evidencia circunstancial que estas partculas tienen buena


actividad antimicrobiana; sin embargo, el mecanismo exacto por
el que estas partculas ejercen esta actividad es todava
especulativo. Las nanopartculas tienen una amplio espectro de
accin contra una gama de microbios probablemente debido a
que tienen multiples mecanismos de accin.
Se demostr que las NPAg es un efectivo antimicrobiano incluso
en el caso de Salmonella, pero esto es fuertemente dependiente
de la cepa.
Se observ en los serotipos investigados diferencias en trminos
de dosis efectiva y tiempo de accin, debido probablemente a
factores relacionados con caractersticas genticas de cada cepa
(genes de resistencia).
Los mecanismos de resistencia incluyen alteracin de membranas
celulares y disminucin de la entrada de Ag por bombas de eflujo.
Los genes de resistencia a la plata se asume que pueden ser
expresados en respuesta a una exposicin a largo plazo con
plata.

Discusiones
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Los

ensayos de susceptibilidad de NPAg demostraron que estas son efectivas


como antimicrobianos contra cepas de Salmonella solamente durante un corto
periodo de tiempo. Esto sugiere que la habilidad de los patgenos de
sobrevivir en la presencia de NPAg puede ser un reto para la aplicacin
propuesta.
La mayor actividad del nitrato de plata comparada con las NPAg, sugiere que
los iones son los elementos mas efectivos ejerciendo actividad antibacteriana.
Sin embargo, se necesita mas evidencia para apoyar esta hiptesis.
Es importante destacar que solo se tomo en cuanta un solo tipo de
nanopartcula, por lo que los resultados no se pueden generalizar debido a la
amplia variabilidad de actividad biolgica de NP que depende no solamente de
su forma qumica sino tambin de su forma especfica y de su rango
dimensional.
El tamao mas pequeo de NPAg
(<10nm) se demostr que tiene alta
actividad antimicrobiana que las partculas largas. En consecuencia en otro
estudio se demostr que las partculas en forma triangular eran mas activas
como antimicrobiano que las partculas con formas de bastn y esfricas. Esto
indica que su rea de superficie es importante para su actividad.
Por lo tanto, los efectos inhibitorios o antibacterianos sobre Salmonella tienen
que ser evaluado caso por caso.

Conclusiones
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