Aislamiento de

Bacterifagos
Giovanna Daz
Vctor Snchez
Oswin Uras
Jos Verdugo

Introduccin

Los Fagos, son virus que infectan especficamente

bacterias.

Fueron descritos por Frederick Twort (1915)

Existen 13 familias de fagos que se clasifican de

acuerdo a su naturaleza genmica y caractersticas
morfolgicas

Mecanismos de Replicacin del Fago

Objetivo
Lograr el aislamiento y la
cuantificacin de
bacterifagos utilizando
tcnicas adecuadas.

Materiales y mtodos
Materiales
Aguas negras
Cepa de E. coli

Material de laboratorio

Tubos de ensaye de 16 X150 mm estriles

Tubo de ensaye de 16 X 150 mm con 10 mL de caldo nutritivo ms

extracto de levadura al 1%.

Tubo de ensaye de 16 x150 mm con 10 ml de sol. Salina estril

Tubos de ensaye de 13x100 mm estriles

Tubos de ensaye de 13x100 mm con 3 ml de agar al 0.75% de agar

(fundido)

Cajas de Petri con agar nutritivo ms extracto de levadura al 1%.

Pipetas de 1, 2 y 5 ml estriles

Hisopos estriles

Pipetas Pasteur estriles

Metodologa
Aislamiento de fagos
1. Agregar 3 ml de solucin salina estril en una
caja con crecimiento masivo de la bacteria
hospedera. (aislada y purificada previamente de
la muestra)
2. Cosechar el crecimiento con un hisopo estril y
colocar la suspensin gruesa en un tubo de 15 x
150 mm con una pipeta Pasteur estril.
3. Colocar en otro tubo de 16 x 150 mm estril 2 ml
de la muestra previamente filtrada por papel
Whatman y membrana de 0.45 mm. Aadir 2 ml
de caldo nutritivo con extracto de levadura y 0.5
ml de la suspensin gruesa de bacterias.

4. Incubar el sistema durante 24 h a

37C
5. despus de incubar, centrifugar el
contenido del tubo a 10000 rpm
durante 10 minutos. Separar el
sobrenadante por decantacin.
6. Agregar benzal al tubo que contiene
el sedimento antes de desecharlo
7. Filtrar el sobrenadante a travs de
una membrana de 0.45 mm.

8. Preparar una suspensin gruesa a

partir de cultivos de la bacteria de
18 horas, igual que en el punto 2.
9. Sembrar esta suspensin gruesa
en una caja, usando un hisopo
estril.
10. Dejar secar el inculo por 30 min.

11. Con una pipeta Pasteur colocar

unas gotas del sobrenadante
que se espera contenga fagos,
en la caja sembrada con la
bacteria.
12.Incubar a 37C durante 24 h.
13.Observar las cajas en bsqueda
de placas lticas.

Titulacin de fagos
1. Hacer una serie de diluciones
decimales de la suspensin del
bacterifago, de 10^-1 hasta 10^-6
en caldo nutritivo ms extracto de
levadura (0.1:0.9 ml)
2. Tomar 0.1 ml de cada una de las tres
ltimas diluciones y adicionarlo a
tubos de ensaye con 3 ml de agar al
0.75 fundido (45C). a partir de este
momento, trabajar rpidamente para
evitar que solidifique el agar y no se
homogenice bien.

3. Una vez aadido el fago, agregar a

cada tubo 0.1 ml de la suspensin
concentrada de una bacteria sensible
al fago.
4. Homogenizar el contenido del tubo
por rotacin entre las manos y vaciar
rpidamente en una caja de agar
enriquecido con extracto de levadura.
5. Distribuir el contenido del tubo en
toda la superficie, por rotacin de la
caja sobre la mesa.

6. Dejar solidificar e incubar a 37C

por 24 horas.
7. Observar las cajas, e interpretar
el resultado, si es positivo habr
placas lticas que se observan
como zonas claras que indican
la destruccin de las bacterias.

8. Contar las placas lticas presentes en cada dilucin y determinar

el ttulo del fago.
9.

Calcular el ttulo fgico con la siguiente frmula:

Ttulo fgico =